Nukleotid-Exzisionsreparatur (2023)

KAPITEL 7

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Die meisten biologischen Moleküle haben eine begrenzte Lebensdauer. Viele Proteine, Lipide und RNAs werden abgebaut, wenn sie nicht mehr benötigt oder beschädigt werden, und kleinere Moleküle wie Zucker werden zu Verbindungen verstoffwechselt, um Energie zu erzeugen oder zu speichern. Im Gegensatz dazu ist DNA das stabilste bekannte biologische Molekül, was seiner Rolle bei der Speicherung genetischer Informationen gerecht wird. Die DNA wird von Generation zu Generation weitergegeben und erst abgebaut, wenn Zellen sterben. Es kann sich jedoch ändern, ist also veränderlich.Mutationenoder Änderungen in der Nukleotidsequenz können durch Fehler während der DNA-Replikation, durch kovalente Strukturänderungen aufgrund von Reaktionen mit chemischen oder physikalischen Stoffen in der Umgebung oder durch Transposition verursacht werden. Die meisten Sequenzänderungen sindrepariertin Zellen. Einige der wichtigsten Möglichkeiten zur Veränderung von DNA-Sequenzen und zur Reparatur dieser Mutationen werden in diesem Kapitel besprochen.

Sequenzveränderungen in der genomischen DNA sind der Treibstoff, der den Lauf der Evolution vorantreibt. Ohne solche Mutationen würde es in den Artenpopulationen keine Veränderungen geben, die es ihnen ermöglichen würden, sich an Veränderungen in der Umwelt anzupassen. Mutationen in der DNA von Keimbahnzellen lassen sich hinsichtlich ihrer Auswirkung auf die Evolution in drei Kategorien einteilen. Die meisten haben keinen Einfluss auf den Phänotyp; Dazu gehören Sequenzveränderungen im großen Teil des Genoms, der weder für Proteine kodiert noch an der Genregulation oder anderen Prozessen beteiligt ist. Einige davonneutralMutationen werden in einer Population von Organismen (bzwFest) über lange Zeiträume durch stochastische Prozesse. Andere Mutationen haben einen Phänotyp, der für die Träger dieser Mutation von Vorteil ist. Diese Mutationen werden in Populationen schnell fixiert (d. h. sie unterliegenpositive Auswahl). Andere Mutationen haben einen schädlichen Phänotyp und werden schnell aus der Population entfernt. Sie unterliegenNegativoderreinigende Auswahl.

Ob eine Mutation neutral, nachteilig oder nützlich ist, hängt davon ab, wo sie sich im Genom befindet, um welche Art von Veränderung es sich handelt und welche Einzelheiten die Umweltkräfte auf den Ort einwirken. Für unsere Zwecke ist es wichtig zu erkennen, dass Sequenzänderungen ein natürlicher Teil des DNA-Stoffwechsels sind. Die Menge und Art der Mutationen, die sich in einem Genom anhäufen, werden jedoch durch die Art und Konzentration der Mutagene, denen eine Zelle oder einen Organismus ausgesetzt ist, die Effizienz relevanter Reparaturprozesse und die Auswirkung auf den Phänotyp im Organismus bestimmt.

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Mutationen und Mutagene

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Arten von Mutationen

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Mutationen sind häufigSubstitutionen, bei dem ein einzelnes Nukleotid in ein anderes Nukleotid umgewandelt wird. Andere Mutationen führen zum Verlust (Streichung) oderAddition (Einfügen) aus einem oder mehreren Nukleotiden. Diese Insertionen oder Deletionen können zwischen einem und mehreren zehntausend Nukleotiden liegen. Oftmals wird aus dem Vergleich zweier homologer Sequenzen auf eine Insertion oder Deletion geschlossen, und es kann unmöglich sein, anhand der gegebenen Daten festzustellen, ob das Vorhandensein eines Segments in einer Sequenz, aber nicht in einer anderen, auf die Insertion einer Deletion zurückzuführen ist. In diesem Fall kann es als bezeichnet werdenindel. Ein Mechanismus für große Einfügungen ist derUmsetzungeiner Sequenz von einer Stelle im Genom zu einer anderen (beschrieben in Kapitel 9).

Nukleotidsubstitutionen sind eine von zwei Klassen. In einemÜbergang, ein Purinnukleotid wird durch ein Purinnukleotid ersetzt, oder ein Pyrimidinnukleotid wird durch ein Pyrimidinnukleotid ersetzt. Mit anderen Worten: Die Base im neuen Nukleotid gehört zur gleichen chemischen Klasse wie die des ursprünglichen Nukleotids. In einemUmwandlung, ändert sich die chemische Klasse der Base, d. h. ein Purinnukleotid wird durch ein Apyrimidinnukleotid ersetzt, oder ein Pyrimidinnukleotid wird durch ein Purinnukleotid ersetzt.

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Abbildung 7.1. Diagramm der Substitutionsarten: Übergänge und Transversionen.

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Ein Vergleich der Sequenzen homologer Gene zwischen Arten zeigt eine ausgeprägte Präferenz für Übergänge gegenüber Transversionen (etwa zehnfach), was darauf hindeutet, dass Übergänge viel häufiger auftreten als Transversionen.

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Fehler bei der Replikation

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Trotz effektiver Korrekturlesefunktionen in vielen DNA-Polymerasen wird gelegentlich das falsche Nukleotid eingebaut. Es wird geschätzt, dassE coliDas Holoenzym der DNA-Polymerase III (mit einer voll funktionsfähigen Korrekturleseaktivität) verwendet bei der Verlängerung etwa 1 von 10 das falsche Nukleotid⁸mal. Es ist wahrscheinlicher, dass ein falsches Pyrimidinnukleotid gegenüber einem Purinnukleotid im Matrizenstrang eingebaut wird und dass ein Purinnukleotid gegenüber einem Pyrimidinnukleotid eingebaut wird. Daher kommen diese Fehleinbauten, die zu einer Übergangssubstitution führen, häufiger vor. Der Einbau eines Pyrimidinnukleotids gegenüber einem anderen Pyrimidinnukleotid oder eines Purinnukleotids gegenüber einem anderen Purinnukleotid kann jedoch auftreten, wenn auch mit zunehmend geringerer Häufigkeit. Diese selteneren Fehleingliederungen führen zu Umwandlungen.

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Frage 7.1. Wenn ein dCTP wird in einen wachsenden DNA-Strang gegenüber von eingebautAWelche Mutation wird im Template-Strang entstehen? Ist es ein Übergang oder eine Transversion?

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Frage 7.2. Wenn ein dCTP wird in einen wachsenden DNA-Strang gegenüber a eingebautTWelche Mutation wird im Template-Strang entstehen? Ist es ein Übergang oder eine Transversion?

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Eine Änderung der isomeren Form der Apurin- oder Pyrimidinbase in einem Nukleotid kann zu einer Mutation führen. Die Basenpaarungsregeln basieren auf der Wasserstoffbrückenbindungsfähigkeit von Nukleotiden mit ihren Basen imKetoTautomer Ein Nukleotid, dessen Base in der liegtEnolTautomer kann mit der „falschen“ Base in einem anderen Nukleotid paaren. Beispielsweise gibt es dort ein TEnolIsomer paart sich mit aKetoG (Abb. 7.2) und anEnolG wird mit a gepaartKetoT.

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Abbildung7.2.Illustration des NukleosidsEnol5-Bromdesoxyuridin (oder 5-BrdU, ein Analogon von Thymidin), gepaart mit dem NukleosidKeto Desoxyguanidin. 5-BrdU verschiebt sich in dieEnolschneller tautomer als Thymidin.

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DerEnolTautomeren der normalen Desoxynukleotide Guanidylat und Thymidylat sind selten, was bedeutet, dass ein einzelnes Molekül darin vorkommtKetobilden sich die meiste Zeit oder innerhalb einer Population von Molekülen, die meisten von ihnen befinden sich in derKetoform. Bestimmte Nukleosid- und Basenanaloga übernehmen diese alternativen Isomere jedoch leichter. Beispielsweise ist 5-Brom-Desoxyuridin (oder 5-BrdU) ein Analogon von Desoxythymidin (dT), das in enthalten istEnolTautomer ist häufiger als dT (obwohl es meistens in der ist).KetoTautomer).

Somit kann die Häufigkeit von Fehleinbauten durch Wachstum in Gegenwart von Basen- und Nukleosidanaloga erhöht werden. Beispielsweise führt Wachstum in Gegenwart von 5-BrdU zu einem Anstieg des Einbaus von G gegenüber einem T in der DNA, wie in Abb. dargestellt. 7.3. Nachdem die Zellen das Nukleosid 5-BrdU aufgenommen haben, wird es durch Nukleotid-Salvage-Enzyme, die Phosphate an sein 5Õ-Ende hinzufügen, in 5-BrdUTP umgewandelt. Während der Replikation wird 5-BrdUTP (imKetoTautomer) wird gegenüber einem A in die DNA eingebaut. Die 5-BrdU kann in die wechselnEnolbildet sich in der DNA, so dass es, wenn es während der nächsten Replikationsrunde als Vorlage dient (Pfeil 1 im Diagramm unten), den Einbau eines G in den komplementären Strang steuert. Dieses G steuert wiederum den Einbau eines C in den oberen Strang in der nächsten Replikationsrunde (Pfeil 2). Dies hinterlässt ein C:G-Basenpaar, wo in der Eltern-DNA ein T:A-Basenpaar vorhanden war. Sobald sich das Pyrimidin wieder in die gewünschte Position verschiebtKetoTautomer, es kann den Einbau eines A steuern, um das zweite Produkt im Diagramm unten zu ergeben (mit einem BrU-A-Basenpaar).

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Frage 7.3. Wo sind die Wasserstoffbrückenbindungen in einem Basenpaar dazwischen?EnolÐguanidin undKeto-Thymidin in der DNA?

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Abbildung 7.3.Die Replikation eines falsch eingebauten Nukleotids (oder Nukleotidanalogs) führt zu einer Mutation.

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Ebenso kann es zu einem Fehleinbau von A und C kommen, wenn diese selten vorkommenImmunTautomeren statt der bevorzugtenAminoTautomeren. Insbesondere,ImmunC wird mit gekoppelt AminoA, undImmunA wird mit gepaartAminoC (Abb. 7.4).

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Abbildung 7.4.Ein A in der SeltenheitImmunTautomer wird mit gekoppeltAminoC. Dies kann einen Übergang von A:T zu G:C verursachen.

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Eine Fehleingliederung während der Replikation ist der Hauptweg für die EinführungTransformationenin DNA. Normalerweise besteht die DNA aus einer Reihe von Purin-Pyrimidin-Basenpaaren, aber um eine Transversion durchzuführen, muss ein Pyrimidin mit einem anderen Pyrimidin oder ein Purin mit einem Purin gepaart werden. Die DNA muss lokale Strukturveränderungen durchlaufen, um diese ungewöhnlichen Basenpaare aufzunehmen. Dies kann bei einem Purin-Purin-Basenpaar beispielsweise dadurch geschehen, dass eines der Purinnukleotide vom bevorzugten Nukleotid abweichtAntiKonformation an diesynKonformation. Atome auf der „Rückseite“ des Purinnukleotids imsyn-Isomerkann Wasserstoffbrückenbindungen mit Atomen im seltenen Tautomer des Purinnukleotids bilden, noch im bevorzugtenAntiKonformation. Zum Beispiel ein A-Nukleotid in dersyn-,Amino-Isomer kann sich mit einem A-Nukleotid im verbindenAnti-,Immun-Form (Abb. 7.5). Somit erforderte die Transversion eine Verschiebung der tautomeren Form der Base in einem Nukleotid sowie eine Änderung der Basen-Zucker-Konformation (AntiZusyn) des anderen Nukleotids.

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Abbildung 7.5.Ein Basenpaar zwischen asyn-,Amino-Isomer von A und demAnti-,Immun- Form von A.

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Frage 7.4. Warum erfolgt die Verschiebung eines Purinnukleotids?AntiZusynHelfen Sie dabei, ein Purin:Purin-Basenpaar zu ermöglichen? Wird dies für ein Pyrimidin:Pyrimidin-Basenpaar benötigt?

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Fehler bei der Replikation sind nicht auf Ersetzungen beschränkt.SchlupffehlerWährend der Replikation werden Nukleotide hinzugefügt oder gelöscht. Eine DNA-Polymerase kann zusätzliche Nukleotide einfügen, häufiger, wenn Tandem-Kurzwiederholungen die Vorlage sind (z. B. sich wiederholende CA-Dinukleotide). Manchmal kann der Matrizenstrang ausschleifen und eine Sekundärstruktur bilden, die die DNA-Polymerase nicht liest. In diesem Fall kommt es zu einer Deletion im entstehenden Strang. Die Fähigkeit von Interkalationsmitteln, die Häufigkeit solcher Löschungen zu erhöhen, ist in Abb. 7.10.B dargestellt. (siehe unten).

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Reaktion mit Mutagenen

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Viele Mutationen resultieren nicht aus Replikationsfehlern. Chemische Reagenzien können die Basen in der DNA oxidieren und alkylieren und manchmal ihre Basenpaarungseigenschaften verändern. Strahlung kann auch die DNA schädigen. Beispiele dieser mutagenen Reaktionen werden in diesem Abschnitt besprochen.

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Chemische Modifikation durch Oxidation

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Wenn die Aminobasen Adenin und Cytosin oxidiert werden, verlieren sie auch eine Aminogruppe. Somit wird das Amin im Produkt dieser oxidativen Desaminierungsreaktion durch eine Ketogruppe ersetzt. Beispielsweise entsteht durch die Oxidation von Cytosin Uracil, das eine Basenpaarung mit Adenin bildet (dargestellt für Desoxycytidin in Abb. 7.6). Ebenso ergibt die Oxidation von Adenin Hypoxanthin, das eine Basenpaarung mit Cytosin bildet (Abb. 7.7.A). Daher werden die Produkte dieser chemischen Reaktionen Mutationen in der DNA sein, wenn sie nicht repariert werden. Durch Oxidation von Guanin entsteht Xanthin (Abb. 7.7.B). In der DNA paart sich Xanthin mit Cytosin, ebenso wie das ursprüngliche Guanin, sodass diese besondere Veränderung nicht mutagen ist.

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(Video) Nucleotide Excision Repair

Abbildung 7.6.Durch oxidative Desaminierung von Desoxycytidin entsteht Desoxyuridin. Das Desoxyuridin in der DNA würde die Paarung mit dA nach der Replikation steuern.

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Abbildung 7.7.A.Struktur von Hypoxanthin, dem Produkt der oxidativen Desaminierung von Adenin.

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Abbildung 7.7.B.Struktur von Xanthin, dem Produkt der oxidativen Desaminierung von Guanin.

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Frage 7.5. Sowohl Hypoxanthin als auch Xanthin können Basenpaare mit Cytosin in der DNA bilden. Warum ist das?

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Die Oxidation von C zu U erfolgt spontan mit hoher Geschwindigkeit. Die Häufigkeit ist so groß, dass 1 von 1000 Cs im menschlichen Genom im Laufe eines Lebens zu uns werden würde, wenn sie nicht repariert würden. Wie später erläutert wird, haben sich Reparaturmechanismen entwickelt, um ein U in der DNA durch ein T zu ersetzen.

Durch die Methylierung von C vor seiner oxidativen Desaminierung wird es effektiv vor den Reparaturprozessen zur Entfernung von UÕs aus der DNA maskiert. Dies hat erhebliche Auswirkungen auf die Genome von Organismen, die C methylieren. In vielen Eukaryoten, einschließlich Wirbeltieren und Pflanzen (jedoch nicht in Hefe oderDrosophila) erkennt die Haupt-DNA-Methyltransferase das Dinukleotid CpG in der DNA als Substrat und bildet 5-Methyl-CpG (Abb. 7.8). Bei der oxidativen Desaminierung von 5-Methylcytosin entsteht 5-Methyluracil, das mit Thymin identisch ist. Das Überwachungssystem, das UÕs in der DNA erkennt, verändert das T nicht, da es ein normaler Bestandteil der DNA ist. Daher führt die Oxidation von 5-Methyl-CpG zu TpG, gefolgt von einer Replikationsrunde, zu einem C:G-zu-T:A-Übergang an den ehemaligen CpG-Stellen (Abb. 7.8). Diese spontane Desaminierung kommt ziemlich häufig vor; tatsächlich sind C-zu-T-Übergänge an CpG-Dinukleotiden die häufigsten Mutationen beim Menschen. Da dieser Übergang nicht repariert wird, nimmt die Anzahl der CpGdinukleotide im Genom von Wirbeltieren und Pflanzen mit der Zeit stark ab.

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Chemische Modifikation durch Alkylierung

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Viele Mutagene sindAlkylierungsmittel. Das bedeutet, dass sie einer Base in der DNA eine Alkylgruppe wie Methyl oder Ethyl hinzufügen. Beispiele für häufig verwendete Alkylierungsmittel im Labor sind N-Methyl-Nitrosoguanidin und N-Methyl-N'-Nitro-Nitrosoguanidin (MNNG, Abb. 7.9.A.). Auch die chemischen Kampfstoffe Schwefelsenf und Stickstoffsenf sind Alkylierungsmittel.

N-Methyl-Nitrosoguanidin und MNNG übertragen eine Methylgruppe auf Guanin (z. B. auf das O⁶Position) und andere Basen (z. B. Bildung von 3-Methyladenin aus Adenin). Die zusätzliche Methylgruppe (oder eine andere Alkylgruppe) führt zu einer Verzerrung der Helix. Die verzerrte Helix kann die Eigenschaften der Basenpaarung verändern. Zum Beispiel O6-Methylguanin bildet manchmal eine Basenpaarung mit Thymin (Abb. 7.9.B.).

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A. N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG)

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B. 6-O-Methyl-G wird mit T gepaart

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Abbildung 7.9.A. Struktur von MNNG und dem Basenpaar zwischen O6-Methyl G und T

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Die Reihenfolge der Reaktivität nukleophiler Zentren in Purinen folgt ungefähr dieser Reihe:

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N7-G >> N3-A > N1-A@N3-G@Ö6-G.

Ein gängiges Laborreagenz für Purine in DNA ist Dimethylsulfat oder DMS. Die Produkte dieser Reaktion sind hauptsächlich N⁷-Guanin,aber N³-Adenin ist ebenfalls nachweisbar. Diese Reaktion wird verwendet, um Proteinbindungsstellen in der DNA zu identifizieren, da die Interaktion mit einem Protein zu einer erhöhten Reaktivität von Guaninen gegenüber DMS innerhalb der Bindungsstelle, aber zu einer erhöhten Reaktivität in der Nähe der Stelle führen kann. Methylierung zu N7-Methylguanin verursacht keine Fehlkodierung in der DNA, da dieses modifizierte Purin immer noch mit C paart.

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Chemikalien, die Löschungen verursachen

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Einige Verbindungen verursachen einen Verlust von Nukleotiden aus der DNA. Wenn diese Deletionen in einer proteinkodierenden Region der genomischen DNA auftreten und kein ganzzahliges Vielfaches von 3 sind, führen sie zu einer Frameshift-Mutation. Hierbei handelt es sich häufig um schwerwiegendere Mutationen mit Funktionsverlust als um einfache Substitutionen. Frameshift-Mutagene wie Proflavin oder Ethidiumbromid weisen flache, polyzyklische Ringstrukturen auf (Abb. 7.10.A.). Sie können an und bindenZWISCHENinnerhalb der DNA, d. h. sie können sich zwischen gestapelten Basenpaaren einfügen. Wenn ein Abschnitt der Matrizen-DNA herausgeschleift wird, kann sich die DNA-Polymerase daran vorbei replizieren und dadurch eine Deletion erzeugen. Interkalierende Agenzien können dadurch Sekundärstrukturen im Kreislauf stabilisieren Dadurch erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, dass dieses Segment in der Schleife bleibt und während der Replikation nicht kopiert wird (Abb. 7.10.B). Somit erhöht das Wachstum von Zellen in Gegenwart solcher interkalierenden Wirkstoffe die Wahrscheinlichkeit einer Deletion.

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Abbildung 7.10.Zwei interkalierende Wirkstoffe (A) und ihre Fähigkeit, Schleifen in der Matrize zu stabilisieren, was zu Deletionen im entstehenden DNA-Strang führt (B). Benz(a)pyrene sind im Ruß enthalten.

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Ionisierende Strahlung

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Hochenergetische Strahlung, wie zum Beispiel Röntgenstrahlen,G-Strahlen undBTeilchen (oder Elektronen) sind starke Mutagene. Da sie die Anzahl der Elektronen in einem Atom verändern und eine Verbindung in eine ionisierte Form umwandeln können, werden sie als „Elektronen“ bezeichnetionisierende Strahlung. Sie können eine Reihe chemischer Veränderungen in der DNA verursachen, einschließlich der direkten Zerstörung des Phosphodiester-Rückgrats der DNA, was zu Deletionen führt. Auch ionisierende Strahlung kann die Imidazolierung von Purinen aufbrechen. Die anschließende Entfernung des beschädigten Purins aus der DNA durch Aglycosylase erzeugt eine Apurinstelle.

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UV-Strahlung

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Es entsteht ultraviolette Strahlung mit einer Wellenlänge von 260 nmPyrimidin-Dimerezwischen benachbarten Pyrimidinen in der DNA. Es gibt zwei Arten von Dimeren (Abb. 7.11). Das Hauptprodukt ist ein Cytobutan-haltiges Thymin-Dimer (zwischen C5 und C6 benachbarter Ts). Das andere Produkt hat eine kovalente Bindung zwischen der Position 6 auf einem Pyrimidin und Position 4 auf dem benachbarten Pyrimidin, daher wird es „6-4“-Photoprodukt genannt.

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(Video) Was sind DNA-Reparaturmechanismen? Nukleotidexizisionsreparatur erklärt | Basenexizisionsreparatur

Abbildung 7.11.Durch UV-Strahlung gebildete Pyrimidin-Dimere, dargestellt für benachbarte Thymidylate an einem DNA-Strang. (A) Durch die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen den C-Atomen an Position 5 jedes Pyrimidins und zwischen den C-Atomen an Position 6 jedes Pyrimidins entsteht ein Cyclobutanring, der die beiden Pyrimidine verbindet. Die Basen sind übereinander gestapelt und werden durch den Cyclobutanring an Ort und Stelle gehalten. Die C-C-Bindungen zwischen den Pyrimidinen sind in dieser Zeichnung übertrieben dargestellt, sodass der Pyrimidinring sichtbar ist. (B) Ein weiteres Fotoprodukt entsteht durch die Bildung einer Bindung zwischen dem C-Atom an dieser Position 6 eines Pyrimidins und Position 4 des benachbarten Pyrimidins, wobei das zuvor an Position 4 gebundene O verloren geht.

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Die Pyrimidin-Dimere verursachen eine Verzerrung der DNA-Doppelhelix. Diese Verzerrung blockiert die Replikation und Transkription.

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Frage7.7. Was ist die physikalische Grundlage für diese Verzerrung in der DNA-Doppelhelix?

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Zusammenfassung: Ursachen von Übergängen und Transversionen

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Tabelle 7.1 listet mehrere Ursachen für Mutationen in der DNA auf, darunter Mutagene sowie Mutatorstämme in Bakterien. Beachten Sie, dass einige dieser Mutationen zu Fehlpaarungen (Substitutionen) führen, andere zu Verzerrungen der Helix und einige zu beidem.

Übergänge können sowohl durch eine Schädigung der DNA als auch durch einen Fehleinbau während der Replikation erzeugt werden. Transversionen erfolgen hauptsächlich durch Fehleingliederung während der Replikation. Die Häufigkeit solcher Fehler ist bei Mutatorstämmen stark erhöht, z.B. Es fehlt eine Korrekturlesefunktion in der replikativen DNA-Polymerase. Nachdem eine Bakterienzelle ausreichend Schaden erlitten hat, um die SOS-Reaktion auszulösen, wechselt die DNA-Polymerase außerdem in einen fehleranfälligen Replikationsmodus. Dies kann auch eine Quelle mutierter Allele sein.

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Tisch. 7.1.Zusammenfassung der Wirkungen verschiedener Wirkstoffe, die DNA-Sequenzen verändern (Mutagene und Mutatorgene)

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Wirkstoff (Mutagen usw.)	Beispiel	Ergebnis
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Nukleotidanaloga	BrdUTP	Übergänge, z.B. A:T bis G:C
Oxidationsmittel	Salpetersäure	Übergänge, z.B. C:G bis T:A
Alkylierungsmittel	Nitrosoguanidin	Übergänge, z.B. G:C bis A:T
Frameshift-Mutagene	Benz(a)pyren	Löschungen (kurz)
Ionisierende Strahlung	Röntgenstrahlen,G-Strahlen	Brüche und Löschungen (groß)
UV	UV, 260 nm	Y-Dimere, Blockreplikation
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Fehleingliederung:	<![if !supportEmptyParas]><![endif]>	<![if !supportEmptyParas]><![endif]>
Veränderte DNA Pol III	mutD=dnaQ;eUntereinheit der DNA PolIII	Übergänge, Transversionen und Frameshifts in Mutantenstämmen
Fehleranfällige Reparatur	Benötigen Sie UmuC, UmuD, DNA PolIII	Übergänge und Transversionen im Wildtyp während SOS
Andere Mutatorgene	mutM, mutT, mutY	Transversionen in den Mutantenstämmen

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Reparaturmechanismen

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Der zweite Teil dieses Kapitels untersucht die Hauptklassen von DNA-Reparaturprozessen. Diese sind:

Schadensumkehr,

Nukleotidexzisionsreparatur,

Basisexzisionsreparatur,

Fehlanpassung,

Rekombinationsreparatur und

fehleranfällige Reparatur.

Viele dieser Prozesse waren erste Studien an Bakterien wie zE coli, jedoch sind nur wenige auf diese Art beschränkt. Beispielsweise kommen Nukleotid-Exzisionsreparatur und Basen-Exzisionsreparatur in praktisch allen Organismen vor und sind gut charakterisiert in Bakterien, Hefen und Säugetieren. Wie die DNA-Replikation selbst ist auch die Reparatur von Schäden und Fehleinbauten ein sehr alter Prozess.

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Schadensumkehr

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Einige kovalente Veränderungen an Basen in der DNA können direkt rückgängig gemacht werden. Dies geschieht dadurch, dass bestimmte Enzymsysteme die veränderte Base erkennen und Bindungen aufbrechen, um das Addukt zu entfernen oder die Base wieder in ihre normale Struktur umzuwandeln.

Photoreaktivierungist ein lichtabhängiger Prozess, den Bakterien nutzen, um durch UV-Strahlung gebildete Pyrimidin-Dimere umzukehren. Das Enzym Photolyase bindet an ein Pyrimidin-Dimer und katalysiert eine zweite photochemische Reaktion (diesmal mit sichtbarem Licht), die den Cyclobutanring aufbricht und die beiden benachbarten Thymidylate in der DNA neu formiert. Beachten Sie, dass dies formal nicht die Umkehrung der Reaktion zur Bildung der Pyrimidin-Dimere ist, da Energie aus sichtbarem Licht verwendet wird, um die Bindungen zwischen den Pyrimidinen aufzubrechen, und keine UV-Strahlung freigesetzt wird. Das Ergebnis ist jedoch, dass die DNA-Struktur in den Zustand vor der Schädigung durch UV-Strahlung zurückversetzt wurde. Das Photolyase-Enzym hat zwei Untereinheiten, die von kodiert werdenphrAUndPhrBGene inE coli.

Ein zweites Beispiel für die Schadensumkehr ist dieEntfernung von Methylgruppen. Zum Beispiel das EnzymÖ6‑Methylguaninmethyltransferase, kodiert durchadaGen inE coli, erkenntÖ6‑Methylguaninin-Duplex-DNA. Anschließend wird die Methylgruppe entfernt und auf eine Aminosäure des Enzyms übertragen. Das methylierte Enzym ist nicht mehr aktiv, weshalb man von einem Selbstmordmechanismus des Enzyms spricht.

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Exzisionsreparatur

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Das gebräuchlichste Mittel zur Reparatur von Schäden oder einer Nichtübereinstimmung besteht darin, ihn aus der Duplex-DNA herauszuschneiden und den verbleibenden komplementären DNA-Strang erneut zu kopieren, wie in Abb. 7.12 dargestellt. Drei verschiedene Arten der Exzisionsreparatur wurden charakterisiert: Nukleotid-Exzisionsreparatur, Basenexzisionsreparatur und Mismatch-Reparatur. Alle nutzen aausschneiden, kopieren und einfügenMechanismus. ImSchneidenIn diesem Stadium entfernt ein Enzym oder Komplex eine beschädigte Base oder eine Reihe von Nukleotiden aus der DNA. Für dieKopieren, eine DNA-Polymerase (DNA-Polymerase I inE coli) kopiert die Vorlage, um den herausgeschnittenen, beschädigten Strang zu ersetzen. Die DNA-Polymerase kann die Synthese von 3' OH aus initiierenTDer Einzelstrangbruch (Nick) oder die Lücke in der DNA, die nach der Exzision an der Schadensstelle verbleibt. Schließlich in dereinfügenIn diesem Stadium versiegelt die DNA-Ligase den verbleibenden Spalt, um eine intakte, reparierte DNA zu erhalten.

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Abbildung 7.12.Allgemeines Schema für die Exzisionsreparatur, das den Mechanismus zum Ausschneiden (Schritt 1 und 2), Kopieren (Schritt 3) und Einfügen (Schritt 4) veranschaulicht.

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Nukleotid-Exzisionsreparatur

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InNukleotid-Exzisionsreparatur(NER) werden beschädigte Basen innerhalb einer Reihe von Nukleotiden herausgeschnitten und durch DNA ersetzt, wie vom unbeschädigten Matrizenstrang vorgegeben. Dieses Reparatursystem wird verwendet, um durch UV-Strahlung gebildete Pyrimidin-Dimere sowie durch sperrige chemische Addukte modifizierte Nukleotide zu entfernen. Das gemeinsame Merkmal von Schäden, die durch Nukleotid-Exzision repariert werden, besteht darin, dass die modifizierten Nukleotide eine erhebliche Verzerrung der DNA-Helix verursachen. NER kommt in fast allen untersuchten Organismen vor.

Einige der am besten charakterisierten Enzyme, die diesen Prozess katalysieren, sind die UvrABC-Exzinuklease und die UvrD-HelikaseE coli.Die Gene, die diese Reparaturfunktion kodieren, wurden als Mutanten entdeckt, die sehr empfindlich gegenüber UV-Schäden sind, was darauf hindeutet, dass die Mutanten bei der UV-Reparatur defekt sind.Wie in Abb. 7.13 dargestellt, WildtypE coli Erst bei höheren Dosen der UV-Strahlung werden Zellen abgetötet. Es konnten Mutantenstämme identifiziert werden, die wesentlich empfindlicher auf UV-Strahlung reagieren; Diese sind in den für sie erforderlichen Funktionen fehlerhaftUV-RResistenz, abgekürztuvr. Durch das Sammeln einer großen Anzahl solcher Mutanten und deren Prüfung auf ihre Fähigkeit, in Kombination die Resistenz gegen UV-Strahlung wiederherzustellen, wurden Komplementationsgruppen identifiziert. Vier der Komplementationsgruppen oder Gene kodieren Proteine, die bei NER eine wichtige Rolle spielen; das sind sieuvrA, uvrB, uvrCUnduvrD.

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Abbildung7.13.Überlebenskurve von Bakterien, die UV-Strahlung ausgesetzt sind. Bakterienkulturen werden zunehmenden UV-Strahlungsdosen ausgesetzt, die entlang der horizontalen Achse aufgetragen sind. Anschließend werden Proben jeder bestrahlten Kultur ausplattiert und die Anzahl der überlebenden Kolonien gezählt (aufgetragen als logarithmische Funktion auf der vertikalen Achse). Mutantenstämme, die empfindlicher auf UV-Schäden reagieren, weisen einen Defekt in den Genen auf, die die Übertragung auslösenUV-RBeständigkeit, d.h. sie sind fehlerhaftuvrFunktionen.

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Die von der kodierten EnzymeuvrGene wurden im Detail untersucht. Die Polypeptidprodukte deruvrA,uvrB,UnduvrCGene sind Untereinheiten eines Enzyms mit mehreren Untereinheiten, das als „Enzym“ bezeichnet wirdUvrABC-Exzinuklease. UvrA ist das Protein, das von kodiert wirduvrA, UvrB wird von codiertuvrB, usw. Der UvrABC-Komplex erkennt schädigungsbedingte Strukturverzerrungen in der DNA, wie zum Beispiel Pyrimidin-Dimere. Es spaltet dann auf beiden Seiten des Schadens. Dann UvrD (auch Helikase II genannt), das Produkt deruvrDDas Gen wickelt die DNA ab und gibt das beschädigte Segment frei. Somit führen die Proteine UvrABC und UvrD in diesem System eine Reihe von Schritten in der Schneidphase der Exzisionsreparatur durch. Dies hinterlässt ein Substrat mit Lücken zum Kopieren durch DNA-Polymerase und zum Einfügen durch DNA-Ligase.

Die UvrABC-Proteine bilden einen dynamischen Komplex, der Schäden erkennt und auf beiden Seiten endonukleolytische Schnitte durchführt. Durch die beiden Schnitte um den Schaden herum kann das einsträngige Segment, das den Schaden enthält, durch die Helikaseaktivität von UvrD herausgeschnitten werden. Somit können der dynamische UvrABC-Komplex und der UvrBC-Komplex genannt werdenExzinukleasen. Nachdem das beschädigte Segment herausgeschnitten wurde, verbleibt eine Lücke von 12 bis 13 Nukleotiden in der DNA. Diese kann durch DNA-Polymerase aufgefüllt und der verbleibende Spalt durch DNAligase versiegelt werden. Da die unbeschädigte Matrize die Synthese durch die DNA-Polymerase steuert, wird die resultierende Duplex-DNA nicht mehr beschädigt.

Im Detail läuft der Prozess wie folgt ab (Abb. 7.14). UvrA₂(adimer) und Uvr B erkennen die beschädigte Stelle als (UvrA)2UvrB-Komplex. UvrA₂dissoziiert dann in einem Schritt, der eine ATP-Hydrolyse erfordert. Dies ist eine autokatalytische Reaktion, da sie durch UvrA katalysiert wird, das selbst eine ATPase ist. Nach UvrA ist dissoziiert, UvrB bildet (an der beschädigten Stelle) einen Komplex mit UvrC. Der UvrBC-Komplex ist die aktive Nuklease. In einem weiteren Schritt, der ATP erfordert, werden die Einschnitte auf beiden Seiten des Schadens vorgenommen. Das Phosphodiester-Rückgrat wird 8 Nukleotide auf der 5'-Seite des Schadens und 4-5 Nukleotide auf der 3'-Seite gespalten. Schließlich wickelt die UvrD-Helikase die DNA ab, sodass das beschädigte Segment entfernt wird. Das beschädigte DNA-Segment löst sich vom UvrBC-Komplex. Wie bei allen Helikase-Reaktionen erfordert die Entwindung eine ATP-Hydrolyse, um die Basenpaare aufzubrechen. Daher ist in drei Schritten dieser Reaktionsreihe eine ATP-Hydrolyse erforderlich.

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Abbildung 7.14.DieUvr(A)BC-Exzinuklease vonE colierkennt AP-Standorte, Thymin-Dimere und andere Strukturverzerrungen und bilden Kerben auf beiden Seiten der beschädigten Region. Das 12–13 Nukleotide lange Fragment wird zusammen mit der Exzinuklease durch Helikase II-Wirkung freigesetzt.

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Frage 7.8. Wie unterscheidet sich eine Exzinuklease von einer Anexonuklease und einer Endonuklease?

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Die Nukleotidexzisionsreparatur ist in Säugetierzellen sowie in Zellen anderer Organismen sehr aktiv. Die DNA einer normalen Hautzelle, die dem Sonnenlicht ausgesetzt ist, würde täglich Tausende von Dimeren ansammeln, wenn dieser Reparaturprozess sie nicht entfernen würde! Eine genetisch bedingte Erkrankung des Menschen, Xeroderma pigmentosum (XP), ist eine Hauterkrankung, die durch einen Defekt von Enzymen verursacht wird, die UV-Läsionen entfernen. Aus einzelnen XP-Patienten isolierte Fibroblasten sind bei Kulturanzucht deutlich empfindlich gegenüber UV-Strahlung, ähnlich dem Phänotyp, der in gezeigt wirdE coli uvrMutanten. Diese XP-Zelllinien können in Kultur fusioniert und auf ihre Fähigkeit getestet werden, die Resistenz gegen UV-Schäden wiederherzustellen. XP-Zelllinien, die dies tun, fallen in verschiedene Komplementationsgruppen. Auf diese Weise wurden mehrere Komplementationsgruppen oder Gene definiert. Bei der Identifizierung der von jedem XP-Gen kodierten Proteine wurden kürzlich erhebliche Fortschritte erzielt (Tabelle 7.2). Beachten Sie die enge Analogie zu den für NER erforderlichen bakteriellen Funktionen. Ähnliche Funktionen finden sich auch in Hefe (Tabelle 7.2). Zu den weiteren Proteinen, die in eukaryotischem NER verwendet werden, gehören hHR23B (das einen Komplex mit dem DNA-Schadenssensor XPC bildet), ERCCI (das mit dem XPF einen Komplex bildet, um die Inzision 5Õ zur Schadensstelle zu katalysieren) und die verschiedenen anderen Untereinheiten von TFIIH (siehe Kapitel 10). ) und das einzelstrangbindende Protein RPA.

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Tabelle 7.2 Bei XP-Patienten betroffene Gene und kodierte Proteine

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Menschliches Gen	Proteinfunktion	Homolog zu S. cerevisiae	Analog zu E coli
XPA	Bindet beschädigte DNA	Rad14	UvrA/UvrB
XPB	3Õ bis 5Õ Helikase, Bestandteil von TFIIH	Rad25	UvrD
XPC	DNA-Schadenssensor (im Komplex mit hHR23B)	Rad4	<![if !supportEmptyParas]><![endif]>
XPD	5Õ bis 3Õ Helikase, Bestandteil von TFIIH	Rad3	UvrD
XPE	Bindet beschädigte DNA	<![if !supportEmptyParas]><![endif]>	UvrA/UvrB
XPF	Arbeitet mit ERRC1 zusammen, um DNA auf der 5Õ-Seite des Schadens zu schneiden	Rad1	UvrB/UvrC
XPG	Schneidet DNA auf der 3Õ-Seite des Schadens	Rad2	UvrB/UvrC

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NER kommt in vielen Organismen, darunter Bakterien, Hefen und Säugetieren, auf zwei Arten vor. Die eine ist die globale Reparatur, die im gesamten Genom wirkt, und die zweite ist eine spezielle Aktivität, die mit der Transkription gekoppelt ist. Die meisten der in Tabelle 2 aufgeführten XP-Genprodukte funktionieren in beiden NER-Modi in Säugetierzellen. XPC (im Komplex mit einem anderen Protein namens hHR23B) ist jedoch ein DNA-Schadenssensor, der spezifisch für das globale Genom NER ist. Bei der transkriptionsgekoppelten NER bleibt die verlängernde RNA-Polymerase an einer Läsion am Matrizenstrang hängen; Vielleicht ist dies die Schadenserkennungsaktivität für diesen NER-Modus. Einer der basalen Transkriptionsfaktoren, der mit der RNA-Polymerase II assoziiert ist, TFIIH (siehe Kapitel 10), spielt auch bei beiden NER-Typen eine Rolle. Eine seltene genetische Störung beim Menschen, das Cockaynesyndrom (CS), ist mit einem Defekt verbunden, der spezifisch für die transkriptionsgekoppelte Reparatur ist. Es wurden zwei Komplementationsgruppen identifiziert:CSAUndCSBDie Bestimmung der Natur und Aktivität der von ihnen kodierten Proteine wird zusätzliche Einblicke in die effiziente Reparatur transkribierter DNA-Stränge liefern. Der Phänotyp von CS-Patienten ist pleiotrop und zeigt sowohl Lichtempfindlichkeit als auch schwere neurologische und andere Entwicklungsstörungen, einschließlich vorzeitiger Alterung. Diese Symptome sind schwerwiegender als diejenigen, die bei XP-Patienten ohne nachweisbares NER beobachtet werden, was darauf hindeutet, dass die Transkriptionskopplungsreparatur oder die CS-Proteine zusätzlich zu denen für NER Funktionen haben.

Auch andere genetische Erkrankungen resultieren aus einem Mangel an einer DNA-Reparaturfunktion, etwa das Bloom-Syndrom und die Fanconi-Anämie. Dies sind intensive Bereiche der aktuellen Forschung. Eine gute Quelle für aktuelle Informationen zu diesen und anderen Erbkrankheiten sowie zu menschlichen Genen im Allgemeinen ist die Online-Publikation Mendelian Inheritance in Man (OMIM), zugänglich unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Ataxiatelangiektasie oder AT veranschaulicht die Auswirkung von Veränderungen in einem Protein, das nicht direkt an der Reparatur beteiligt ist, sondern möglicherweise Signale sendet, die für die ordnungsgemäße Reparatur der DNA notwendig sind. AT ist eine rezessive, seltene genetische Erkrankung, die durch ungleichmäßigen Gang (Ataxie), Erweiterung der Blutgefäße (Teleangiektasie) in Augen und Gesicht, Kleinhirndegeneration, fortschreitende geistige Behinderung, Immunschwäche, vorzeitiges Altern und eine etwa 100-fache Erhöhung der Anfälligkeit gekennzeichnet ist Krebserkrankungen. Dieser letztgenannte Phänotyp weckt großes Interesse an diesem Genort, da Heterozygoten, die etwa 1 % der Bevölkerung ausmachen, auch ein erhöhtes Krebsrisiko haben und bis zu 9 % der Brustkrebserkrankungen in den Vereinigten Staaten ausmachen können. Das Gen, das istMutated inBEI(daher „ATM“ genannt) wurde 1995 isoliert und auf Chromosom 11q22-23 lokalisiert.

Das ATM-Gen scheint kein Protein zu kodieren, das direkt an der DNA-Reparatur beteiligt ist (im Gegensatz zu den Genen, die bei Mutation XP verursachen). AT wird vielmehr durch einen Defekt im azellulären Signalweg verursacht. Basierend auf Homologien zu anderen Proteinen könnte das ATM-Genprodukt an der Regulierung der Telomerlänge und dem Fortschreiten des Zellzyklus beteiligt sein. Die C-terminale Domäne ist homolog zur Phosphatidylinositol-3-Kinase (die auch eine Ser/Thr-Proteinkinase ist) – daher die Verbindung zu Signalwegen.Das ATM-Protein verfügt auch über Homologiebereiche zu DNA-abhängigen Proteinkinasen, die Brüche, Kerben oder Lücken benötigen, um DNA zu binden (über die Untereinheit Ku); die Bindung an DNA ist für die Proteinkinaseaktivität erforderlich. Dies deutet darauf hin, dass das ATM-Protein daran beteiligt sein könnte, die Reparaturmaschinerie auf solche Schäden auszurichten.

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Reparatur der Basisexzision

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Die Basenexzisionsreparatur unterscheidet sich von der Nukleotidexzisionsreparatur in den erkannten Substrattypen und im anfänglichen Spaltungsereignis. Im Gegensatz zu NER erkennt die Basenexzisionsmaschinerie beschädigte Basen, die keine nennenswerte Verzerrung der DNA-Helix verursachen, wie beispielsweise die Produkte von Oxidationsmitteln. Beispielsweise können durch Basenentfernung Uridine aus der DNA entfernt werden, auch wenn ein G:U-Basenpaar die DNA nicht verzerrt. Die Basenentfernungsreparatur ist vielseitig und dieser Prozess kann auch einige beschädigte Basen entfernen, die die DNA verzerren, wie z. B. methylierte Purine. Im Allgemeinen handelt es sich bei der ersten Erkennung um eine bestimmte beschädigte Base und nicht um eine helikale Verzerrung in der DNA. Ein zweiter wesentlicher Unterschied besteht darin, dass die anfängliche Spaltung auf die glykosidische Bindung gerichtet ist, die die Purin- oder Pyrimidinbase mit Adesoxyribose in der DNA verbindet. Dies steht im Gegensatz zur anfänglichen Spaltung der Aphosphodiesterbindung in NER.

Zellen enthalten eine große Anzahl spezifischerGlykosylasendie beschädigte oder ungeeignete Basen wie Uracil in der DNA erkennen. Die Glykosylase entfernt die beschädigte oder ungeeignete Base, indem sie die Spaltung der N-glykosidischen Bindung katalysiert, die die Base an das Zuckerphosphat-Rückgrat bindet. Zum Beispiel Uracil-N-Glykosylase, das Produkt derungGen, erkennt Uracil in der DNA und schneidet die N-glykosidische Bindung zwischen der Base und der Desoxyribose (Abb. 7.15). Andere Glykosylasen erkennen und spalten beschädigte Basen. Beispielsweise entfernt Methylpuringlykosylase methyliertes G und A aus der DNA. Das Ergebnis der Aktivität dieser Glykosylase ist eine Apurin-/Apyrimidin-Stelle oder AP-Stelle (Abb. 7.15). An einer AP-Stelle ist die DNA immer noch ein intakter Duplex, d. h. es gibt keine Brüche im Phosphodiester-Rückgrat, aber eine Base ist weg.

Als nächstes einAP-Endonukleaseschneidet die DNA nur 5Õ bis zur AP-Stelle und stellt so einen Primer für die DNA-Polymerase bereit. InE coliDie 5'-zu-3'-Exonukleasefunktion der DNA-Polymerase I entfernt den beschädigten Bereich und füllt ihn mit korrekter DNA auf (unter Verwendung der 5'-zu-3'-Polymerase, gesteuert durch die Sequenz des unbeschädigten Komplementärstrangs).

(Video) DNA-Reparatur-Mechanismen: Fotoreaktivierung, Postreplikationsreparatur, Excisionsreparatur |Genetik

Es wurden zusätzliche Mechanismen entwickelt, um UÕs aus der DNA herauszuhalten.E colihat aucheine dUTPase, kodiert durch dieIch habeGen, das die Hydrolyse von dUTP zu dUMP katalysiert. Das Produkt dUMP ist das Substrat für die Thymidylatsynthetase, die die Umwandlung von dUMP in dTMP katalysiert. Dadurch bleibt die dUTP-Konzentration in der Zelle niedrig, wodurch die Wahrscheinlichkeit verringert wird, dass es bei der DNA-Synthese verwendet wird. Somit ist die kombinierte Wirkung der Produkte derIch habe+ungGene tragen dazu bei, die Ansammlung von U's in der DNA zu verhindern.

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Frage 7.9. Welche Enzyme sind bei der Basenexzisionsreparatur spezifisch für eine bestimmte Art von Schaden und welche werden für alle Reparaturen auf diesem Weg verwendet?

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Abbildung 7.15.Die Basenexzisionsreparatur wird durch eine Glykosylase initiiert, die chemisch beschädigte oder ungeeignete Basen in der DNA erkennt und entfernt. Die Glykosylase spaltet die glykosidische Bindung zwischen der Base und dem Zucker und hinterlässt eine anapurinische/apyrimidinische Stelle. Die AP-Endonuklease kann dann das Phosphodiester-Rückgrat 5Õ zur AP-Stelle einkerben. Wenn DNA-Polymerase I das Ende des freien Primers am Bruch bindet, schneidet ihre 5'-3'-Exonukleaseaktivität einige Nukleotide vor der fehlenden Base und ihre Polymerisationsaktivität füllt die gesamte Lücke mehrerer Nukleotide.

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Reparatur von Fehlanpassungen

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Die dritte Art der Exzisionsreparatur, die wir betrachten werden, istReparatur von Fehlanpassungen, das zur Reparatur von Fehlern verwendet wird, die während der DNA-Synthese auftreten. Das Korrekturlesen während der Replikation ist gut, aber nicht perfekt. Sogar mit einer funktionelleneUntereinheit DNA-Polymerase III ermöglicht den Einbau des falschen Nukleotids etwa alle 108bpsynthetisiert inE coli. Allerdings liegt die gemessene Mutationsrate bei Bakterien bei nur einem Fehler pro 1010oder 1011bp. Die Enzyme, die katalysierenReparatur von Fehlanpassungensind für diesen letzten Grad an Genauigkeit verantwortlich. Sie erkennen falsch eingebaute Nukleotide, schneiden sie heraus und ersetzen sie durch die richtigen Nukleotide. Im Gegensatz zur Nukleotid-Exzisionsreparatur funktioniert die Fehlpaarungsreparatur nicht bei sperrigen Addukten oder größeren Verzerrungen der DNA-Helix. Die meisten Fehlpaarungen sind Ersatzstoffe innerhalb einer chemischen Klasse, z. ein C anstelle eines T eingebaut. Dies führt nur zu geringfügigen helikalen Verzerrungen in der DNA, und das falsch eingebaute Nukleotid ist ein normaler Bestandteil der DNA. Die Fähigkeit einer Zelle, Fehlpaarungen zu erkennen, spiegelt die außerordentliche Spezifität von widerDeckel, das normale Basenpaare von solchen unterscheiden kann, die aus einem Fehleinbau resultieren. Natürlich muss die Reparaturmaschinerie wissen, welches der Nukleotide an einem Fehlpaar das richtige ist und welches falsch eingebaut wurde. Dies geschieht, indem es ermittelt, welcher Strang kürzlich synthetisiert wurde, und die Fehlpaarung am entstehenden Strang repariert.

InE coliDie Methylierung von A in einem GATC-Motiv stellt einen kovalenten Marker für den Elternstrang dar, daher wird die Methylierung der DNA verwendet, um Eltern- und Nachkommenstränge zu unterscheiden. Denken Sie daran, dass dieDammMethylasekatalysiert die Übertragung der Amethylgruppe auf das A der pseudopalindromischen Sequenz GATC in Duplex-DNA. Die Methylierung verzögert sich nach der Replikation um mehrere Minuten. In diesem Zeitraum vor der Methylierung des neuen DNA-Strangs kann das Mismatch-Reparatursystem Fehlpaarungen finden und seine Reparaturaktivität auf Nukleotide auf dem nicht methylierten, neu replizierten Strang richten. Dadurch werden Replikationsfehler bevorzugt entfernt.

Der Enzymkomplex MutH-MutL-MutS oder MutHLS katalysiert die Reparatur von FehlpaarungenE coli. Die Gene, die diese Enzyme kodieren,mutH,GlücklichUndDeckelwurden entdeckt, weil Stämme, die Mutationen in sich tragen, eine hohe Häufigkeit neuer Mutationen aufweisen. Dies wird als a bezeichnetMutator-Phänotyp, und daher der Namemutwurde diesen Genen gegeben. Nicht alle Mutatorgene sind an der Reparatur von Fehlpaarungen beteiligt. Beispielsweise weisen Mutationen im Gen, das für das Korrekturleseenzym der DNA-Polymerase III kodiert, auch einen Mutator-Phänotyp auf. Dieses Gen wurde unabhängig bei Tests auf Defekte in der DNA-Replikation entdeckt (dnaQ) und Mutatorgene (mutD). Drei Komplementationsgruppen innerhalb der Gruppe der Mutator-Allele sind hauptsächlich an der Reparatur von Fehlpaarungen beteiligt; diese sindmutH,GlücklichUndDeckel.

Deckelerkennt sieben der acht möglicherweise nicht übereinstimmenden Basenpaare (außer C:C) und bindet an dieser Stelle in der Duplex-DNA (Abb. 7.16).MutHUndGlücklich(mit gebundenem ATP) verbinden sich dann mit dem Komplex, der sich dann entlang der DNA in beide Richtungen bewegt, bis er ein halbmethyliertes GATC-Motiv findet, das einige tausend Basenpaare entfernt sein kann. Bis zu diesem Zeitpunkt war die Nukleasefunktion von MutH inaktiv , wird aber in Gegenwart von ATP an einem hemimethylierten GATC aktiviert. Es spaltet den nicht methylierten DNA-Strang und hinterlässt einen Bruch 5' zum G auf dem Strang, der das nicht methylierte GATC enthält (d. h. den neuen DNA-Strang). Derselbe Strang ist auf der anderen Seite der Nichtübereinstimmung eingekerbt. Enzyme, die an anderen Reparatur- und Replikationsprozessen beteiligt sind, katalysieren die verbleibenden Schritte. Der Abschnitt der einzelsträngigen DNA, der das falsche Nukleotid enthält, soll durch UvrD, auch bekannt als Ashelicase II und MutU, herausgeschnitten werden. SSB und Exonuklease I sind ebenfalls an der Exzision beteiligt. Während der Exzisionsprozess die Lücke bildet, wird sie durch die konzertierte Aktion der DNA-Polymerase III gefüllt (Abb. 7.16.).

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Abbildung 7.16 (Teil 1).Fehlpaarungsreparatur durch MutHLS: Erkennung der Fehlpaarung (rot dargestellt), Identifizierung des neuen DNA-Strangs (unter Verwendung des hemethylierten GATC, blau dargestellt) und Schneiden, um das nichtmethylierte GATC und das falsch eingebaute Nukleotid (rotes G) einzuschließen.

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Abbildung 7.16 (Teil 2).Fehlpaarungsreparatur: Entfernung der DNA mit dem falsch eingebauten Nukleotid bu Uvr D (unterstützt durch Exonuklease I und SSB), Lückenfüllung durch DNA-Polymerase III und Ligation.

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Die Fehlpaarungsreparatur ist hochkonserviert und die Untersuchung dieses Prozesses bei Mäusen und Menschen liefert neue Hinweise auf Mutationen, die Krebs verursachen. Homologe zumE coliGeneGlücklichUndDeckelwurden bei vielen anderen Arten, einschließlich Säugetieren, identifiziert. Der entscheidende Durchbruch gelang durch die Analyse von Mutationen, die eine der häufigsten erblichen Krebsarten verursachen:erblicher nichtpolypöser Dickdarmkrebs(HNPCC). Einige der Gene, die, wenn sie mutiert sind, diese Krankheit verursachen, kodieren Proteine, deren Aminosäuresequenzen denen von zwei der Gene deutlich ähnlich sindE coliFehlpaarungsreparaturenzyme. Die menschlichen Gene werden aufgerufenhMLH1(für MenschenGlücklichHomolog 1),hMSH1, UndhMSH2(für MenschenDeckelHomolog1 bzw. 2). Nachfolgende Arbeiten haben gezeigt, dass diese Enzyme beim Menschen an der Reparatur von Fehlpaarungen beteiligt sind. Vermutlich führt die erhöhte Häufigkeit von Mutationen in Zellen, denen die Reparatur von Fehlpaarungen fehlt, zur Anhäufung von Mutationen in Protoonkogenen, was zu einer Fehlregulation des Zellzyklus und dem Verlust der normalen Kontrolle über die Zellteilungsrate führt.

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Frage 7.10. Die menschlichen Homologen zu bakteriellen Enzymen, die an der Reparatur von Fehlpaarungen beteiligt sind, sind auch an homologen Funktionen beteiligt. Welche enzymatischen Funktionen, die bei der bakteriellen Fehlpaarungsreparatur auftreten, sind angesichts der oben diskutierten Humanhomologen auch beim Menschen zu finden? Welche Funktionen fehlen und werden daher wahrscheinlich von einem Enzym ausgeführt, das nicht homolog zu denen ist, die bei der Reparatur bakterieller Fehlpaarungen verwendet werden?

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Rekombinationsreparatur (Retrieval-System)

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Bei den drei Arten der Exzisionsreparatur werden die beschädigten oder falsch eingebauten Nukleotide aus der DNA herausgeschnitten und der verbleibende DNA-Strang wird für die Synthese der richtigen DNA-Sequenz verwendet. Allerdings ist dieser komplementäre Strang nicht immer verfügbar. Manchmal muss die DNA-Polymerase über eine Läsion hinaus synthetisieren, beispielsweise über ein Apyrimidin-Dimer oder eine AP-Stelle. Eine Möglichkeit besteht darin, auf einer Seite der Läsion anzuhalten und dann etwa 1000 Nukleotide weiter unten mit der Synthese fortzufahren. Dadurch entsteht eine Lücke im Strang gegenüber der Läsion (Abb. 7.17).

Die an der Lücke benötigten Informationen werden aus dem normalen Tochtermolekül abgerufen, indem mithilfe der RecA-vermittelten Rekombination ein einzelner DNA-Strang eingebracht wird (siehe Kapitel VIII). Dadurch wird die Lücke gegenüber dem Dimer gefüllt und das Dimer kann nun durch Exzisionsreparatur ersetzt werden (Abb. 7.17). Die entstandene Lücke in der (vorher) normalen Tochter kann durch DNA-Polymerase unter Verwendung der guten Vorlage gefüllt werden.

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Abbildung 7.17.Rekombinationsreparatur, ein System zum Abrufen von Informationen

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Übersetzungssynthese

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Wie gerade beschrieben, kann die DNA-Polymerase an einer Läsion am Matrizenstrang vorbeispringen und eine Lücke hinterlassen. Wenn eine solche Läsion auftritt, besteht eine weitere Option darin, DNA auf nicht-schablonengesteuerte Weise zu synthetisieren. Das nennt manÜbersetzungssynthese, Bypass-Synthese oder fehleranfällige Reparatur. Dies ist der letzte Ausweg zur DNA-Reparatur, z.B. wenn vor der Replikation keine Reparatur erfolgt ist.Bei der Translesionsreplikation wechselt die DNA-Polymerase von der templatgesteuerten Synthese zur Katalyse des Einbaus zufälliger Nukleotide. Bei diesen zufälligen Nukleotiden handelt es sich in der Regel um Mutationen (d. h. in drei von vier Fällen), weshalb dieser Vorgang auch als fehleranfällige Reparatur bezeichnet wird.

Die Translesionsynthese nutzt die Produkte derumuCUndähmDGene. Diese Gene sind nach dem benanntUV nichtInTabelle Phänotyp von Mutanten mit Defekten in diesen Genen.

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Frage 7.11. Warum führen Mutationen in Genen, die für die Transläsionsynthese (fehleranfällige Reparatur) erforderlich sind, zu anichtveränderlicher Phänotyp?

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UmuD bildet ein Homodimer, das auch mit UmuC einen Komplex bildet. Wenn die Konzentration von einzelsträngiger DNA und RecA erhöht wird (durch DNA-Schädigung, siehe nächster Abschnitt), stimuliert RecA eine Autoproteaseaktivität in UmuD₂um UmuDÕ zu bilden₂.Diese gespaltene Form ist jetzt in der transläsionalen Synthese aktiv. UmuC selbst ist eine aDNA-Polymerase. Ein Komplex mit mehreren Untereinheiten, der UmuC, das aktivierte UmuDÕ, enthält₂und dasAUntereinheit der DNA-Polymerase III katalysiert die transläsionale Synthese. Homologe der UmuC-Polymerase kommen in Hefe (RAD30) und Menschen (XP-V) vor.

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Das SOS Antwort

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Eine koordinierte Batterie von Reaktionen auf DNA-Schäden inE coliwird als SOS-Antwort bezeichnet. Dieser Name leitet sich vom Seenotruf „SOS“ für „Rettet unser Schiff“ ab.

Anhäufende Schäden an der DNA, z.B. Durch hohe Strahlungsdosen, die das DNA-Rückgrat zerstören, entstehen einzelsträngige Regionen in der DNA. Die zunehmenden Mengen einzelsträngiger DNA induzieren SOS-Funktionen, die sowohl die Rekombinationsreparatur als auch die gerade diskutierte transläsionale Synthese stimulieren.

Schlüsselproteine in der SOS-Reaktion sindRecAUndLexA. RecA bindet an einzelsträngige Regionen in der DNA, wodurch neue Funktionen im Protein aktiviert werden. Eine davon ist die Fähigkeit, eine latente proteolytische Aktivität weiter zu aktivieren, die in mehreren Proteinen zu finden ist, einschließlich des LexA-RepressorsUmuDProtein und der von Bakteriophagelambda kodierte Repressor (Abb. 7.18). RecA, das durch Bindung an einzelsträngige DNA aktiviert wird, ist selbst keine Protease, sondern dient vielmehr als Co-Protease und aktiviert die latentproteolytische Funktion in LexA, UmuD und einigen anderen Proteinen.

In Abwesenheit einer nennenswerten DNA-Schädigung unterdrückt das LexA-Protein viele Operons, darunter mehrere Gene, die für die DNA-Reparatur benötigt werden:recA, lexA, uvrA, uvrB, andumuC.Wenn das aktivierte RecA seine proteolytische Aktivität stimuliert, spaltet es sich selbst (und andere Proteine), was zu einer koordinierten Induktion der SOS-regulierten Operons führt (Abb. 7.18).

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Abbildung7.18.RecA und LexA steuern die SOS-Antwort.

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Beschränkungs-/Änderungssysteme

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Die oben besprochenen DNA-Reparatursysteme überwachen das Genom auf Schäden oder Fehleinbauten und bringen dann enzymatisch ein Maschinen zur Behebung der Mängel. Andere Überwachungssysteme in bakteriellen Genomen sindEinschränkungs-/Änderungssysteme. Diese suchen nach fremder DNA, die in die Zelle eingedrungen ist, und zerstören sie dann. Tatsächlich ist dies eine weitere Möglichkeit, das Genom vor Schäden zu schützen, die durch die Integration fremder DNA entstehen könnten.

Diese Systeme zum Schutz der Bakterienzelle vor dem Eindringen fremder DNA nutzen eine Kombination aus kovalenter Modifikation und Restriktion durch eine Endonuklease. Jede Bakterienart verändert ihre DNA durchMethylierungan bestimmten Stellen (Abb. 7.19). Dies schützt die DNA vor der Spaltung durch das entsprechendeRestriktionsendonuklease. Allerdings wird jegliche fremde DNA (z. B. von einem infizierenden Bakteriophagen oder von einer anderen Bakterienart) an dieser Stelle nicht methyliert und die Restriktionsendonuklease wird dort spalten. Das Ergebnis ist, dass eindringende DNA zerschnitten und inaktiviert wird, ohne die Wirts-DNA zu schädigen.

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Abbildung7.19.Restriktions-/Modifikationssysteme in Bakterien.

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Jede DNA, die der Restriktionsendonuklease entgeht, ist ein Substrat für die Methylase. Einmal methyliert, behandelt das Bakterium es nun wie seine eigene DNA, spaltet sie also nicht. Dieser Prozess kann genetisch und biochemisch kontrolliert werden, um die rekombinante DNA-Arbeit zu unterstützen. Im Allgemeinen wird die Restriktionsendonuklease an der kodiertRLocus und die Methyltransferase wird am kodiertMOrt. So wird eine Plasmid-DNA durch eine Plasmid-DNA geleitetR-M+Stamm (defekt in der Restriktion, aber kompetent für Modifikation) macht ihn resistent gegen die Restriktion durch Stämme mit einem WildtypR+Gen. Für einige Restriktions-/Modifikationssysteme sind sowohl die Endonuklease als auch die Methyltransferase im Handel erhältlich. In diesen Fällen kann man die fremde DNA (z. B. von Menschen) vor der Ligation in Klonierungsvektoren modifizieren, um sie vor der Spaltung durch die Restriktionsendonukleasen zu schützen, auf die sie nach der Transformation in Bakterien stoßen könnte.

Bei den Restriktions-/Modifikationssystemen vom Typ II erfolgen Methylierung und Restriktion an derselben pseudopalindromischen Stelle. Dies sind die häufigsten Systeme mit unterschiedlicher Sequenzspezifität für jede Bakterienart.Dadurch entstand die große Vielfalt an Restriktionsendonukleasen, die in der Molekularbiologie so häufig verwendet werden.

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Zusätzliche Lektüre

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Friedberg, E. C., Walker, G. C. und Siede, W. (1995)DNA-Reparatur und Mutagenese, ASM Press, Washington, D.C.

(Video) MedAT 2023 🧬 Lehrvideo zum Stichwort Molekulargenetik des BMS-Teils Biologie 🧬

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Kornberg, A. und Baker, T. (1992)DNA Replikation, 2^ndAuflage, W. H. Freeman and Company, New York.

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Zakian, V. (1995)Geldautomat-verwandte Gene: Was sagen sie uns über die Funktionen des menschlichen Gens?Zelle82: 685-687.

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Kolodner, R.(1996) Biochemie und Genetik der eukaryotischen Fehlpaarungsreparatur.Gene & Entwicklung10:1433-1442.

<![if !supportEmptyParas]><![endif]>

Sutton MD, Smith BT, Godoy VG, Walker GC. (2000) The SOSresponse: Aktuelle Erkenntnisse zur umuDC-abhängigen Mutagenese und DNA-Schadentoleranz.Annu Rev Genet34:479-497.

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De Laat, W. L., Jaspers, N. C. J. und Hoeijmakers, J. H. J. (1999) Molekularer Mechanismus der Nukleotid-Exzisionsreparatur.Gene & Entwicklung13: 768-785. Dieser Aufsatz konzentriert sich auf die Reparatur von Nukleotid-Exzisionen bei Säugetieren.

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Kapitel 7

Mutation und Reparatur von DNA

Fragen

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Frage 7.12 Wenn der oberste Strang des DNAGGTCGTT-Segments für die Reaktion mit salpetriger Säure bestimmt wäre und er dann zwei Replikationsrunden durchliefe, was wären dann die wahrscheinlichen Produkte?

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Frage 7.13 Sind die folgenden Aussagen zur Nukleotid-Exzisionsreparatur inE colirichtig oder falsch?

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A) UvrA und UvrB erkennen strukturelle Verzerrungen, die auf Schäden in der DNA-Helix zurückzuführen sind.

B) Im Komplex mit UvrB spaltet UvrC den beschädigten Strang auf beiden Seiten der Läsion.

C) Die Helikase UvrD entwindet die DNA und löst dadurch die beschädigte Stelle auf.

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Frage 7.14 Sind die folgenden Aussagen zur Reparatur von Fehlanpassungen inE colirichtig oder falsch?

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A) MutS erkennt eine Nichtübereinstimmung.

B) MutL bindet in einem Komplex mit ATP an MutS (gebunden an die nicht übereinstimmende Region) und aktiviert MutH.

C) MutH spaltet 5' zum G des nächstgelegenen methylierten GATC-Motivs (GMichATC).

D) Das Mismatch-Reparatursystem kann zwischen alten und neu synthetisierten DNA-Strängen unterscheiden.

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Für dienächste 6Bei Problemen betrachten Sie die folgende DNA-Sequenz vom ersten Exon desHRASGen. Eine Umwandlung von G zu T an Position 24 verleiht NIH 3T3-Zellen (Fibroblasten) Verankerungsunabhängigkeit und Tumorigenität. Diese Mutation ist ein Schritt in der tumorigenen Transformation von Blasenzellen und spielt wahrscheinlich eine Rolle bei anderen Krebsarten.

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10 2030

5' TAAGCTGGTG GTGGTGGGCG CCGGCGGTGT

3' ATTCGACCAC CACCACCCGC GGCCGCCACA

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Frage 7.15 Wie würde die Sequenz aussehen, wenn das G an Position 14 (oberer Strang) am O alkyliert wäre?6Position durch MNNG und durchlief dann 2 Replikationsrunden?

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Frage 7.16 Wie würde die Sequenz aussehen, wenn das C an Position 24 (unterer Strang) durch HNO oxidiert würde?2und dann zwei Replikationsrunden durchlaufen?

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Frage 7.17 Was würde passieren, wenn diese Sequenz mit UV bei einer Wellenlänge von 260 nm bestrahlt würde?

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Frage 7.18 Wenn Sie für die Aufrechterhaltung dieser DNA-Sequenz verantwortlich wären und über die bekannten enzymatischen Werkzeuge verfügtenE coli, wie würden Sie den Schaden aus Frage 7.15 beheben? Überlegen Sie, was passieren würde, wenn der Schaden vor oder nach der Replikation behoben würde.

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Frage 7.19. Wie könnte

(a)der oxidative Schaden in Problem 7.16 oder

(b)die UV-Produkte in Aufgabe 7.17

repariert?

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Frage 7.20 Nehmen wir an, dass an Position 24 am unteren Strang des darunter liegenden Segments eine C-zu-A-Transversion stattgefunden hat und dass sich ein Segment mit einem GATC etwa 300 bp entfernt befindet.

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10 2030 ... M

5' TAAGCTGGTG GTGGTGGGCG CCGGCGGTGT... GGACGGATCC

3' ATTCGACCAC CACCACCCGC GGCAGCCACA... CCTGCCTAG

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Wenn diese DNA durch das gekennzeichnet istDammMethylase-System ähnlichE coli, wie würde die Nichtübereinstimmung an Position 24 behoben werden? Wie entscheidet die Zelle, welches das richtige Nukleotid ist und welche Enzyme verwendet werden? Erklären Sie in diesem konkreten Beispiel, wie die Enzyme funktionieren.

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Frage 7.21.Das Folgende ist eine Paraphrase aus einer Präsentation auf der Tagung der American Society for Human Genetics im Jahr 2000.

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Die Fanconi-Anämie (FA) ist eine autosomal-rezessiv vererbte Erkrankung, die mit einer Krebsprädisposition einhergeht. Kultivierte Zellen von FA-Patienten weisen ein hohes Maß an spontanen Chromosomenbrüchen auf, was darauf hindeutet, dass FA-Zellen möglicherweise einen Defekt bei der DNA-Reparatur aufweisen. Um diese Hypothese zu testen, wurde die DNA-Endverbindungsaktivität in Kernextrakten von diploiden Fibroblasten der FA-Komplementationsgruppen A und D sowie von mehreren normalen Spendern gemessen. Extrakte von normalen Spendern (Kontrollen) verbanden effizient lineare Plasmidsubstrate, aber Extrakte von FA-Fibroblasten hatten nur 10 % der Aktivität der normalen Kontrollen. Die Zugabe von FA-Extrakt zu normalem Zellextrakt hatte keinen Einfluss auf die Aktivität der letzteren. Wenn jedoch Extrakte aus Fibroblasten der FA-Komplementationsgruppe A mit denen der Komplementationsgruppe D kombiniert wurden, wurden normale Niveaus der DNA-Endverbindungsaktivität wiederhergestellt.

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Welche Schlussfolgerung ziehen Sie aus diesen Daten?

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Frage 7.22.Wie würden Sie verwendenIch habe,ungMutanten für ortsspezifische Mutationen auszuwählen?

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Nukleotid-Exzisionsreparatur (2023)

Arten von Mutationen

Fehler bei der Replikation

Reaktion mit Mutagenen

Chemische Modifikation durch Oxidation

Chemische Modifikation durch Alkylierung

Chemikalien, die Löschungen verursachen

Ionisierende Strahlung

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UV-Strahlung

Zusammenfassung: Ursachen von Übergängen und Transversionen

Schadensumkehr

Nukleotid-Exzisionsreparatur

Reparatur der Basisexzision

Reparatur von Fehlanpassungen

References