7.4: Reparaturmechanismen (2023)

Schadensumkehr

Einige Arten kovalenter Veränderungen an Basen in der DNA können direkt rückgängig gemacht werden. Dies geschieht dadurch, dass bestimmte Enzymsysteme die veränderte Base erkennen und Bindungen aufbrechen, um das Addukt zu entfernen oder die Base wieder in ihre normale Struktur umzuwandeln.

Photoreaktivierungist ein lichtabhängiger Prozess, der von Bakterien genutzt wird, um durch UV-Strahlung gebildete Pyrimidin-Dimere umzukehren. Das Enzym Photolyase bindet an ein Pyrimidin-Dimer und katalysiert eine zweite photochemische Reaktion (diesmal mit sichtbarem Licht), die den Cyclobutanring aufbricht und die beiden benachbarten Thymidylate in der DNA neu formiert. Beachten Sie, dass dies formal nicht die Umkehrung der Reaktion zur Bildung der Pyrimidin-Dimere ist, da Energie aus sichtbarem Licht zum Aufbrechen der Bindungen zwischen den Pyrimidinen verwendet wird und keine UV-Strahlung freigesetzt wird. Das Ergebnis ist jedoch, dass die DNA-Struktur in den Zustand vor der Schädigung durch UV-Strahlung zurückversetzt wurde. Das Photolyase-Enzym hat zwei Untereinheiten, die von kodiert werdenphrAUndPhrBGene inE coli.

Ein zweites Beispiel für die Schadensumkehr ist dieEntfernung von Methylgruppen. Zum Beispiel das EnzymO6-Methylguanin-Methyltransferase, kodiert durch dieadaGen inE coli, erkenntO6‑Methylguanin in Duplex-DNA. Anschließend wird die Methylgruppe entfernt und auf eine Aminosäure des Enzyms übertragen. Das methylierte Enzym ist nicht mehr aktiv, weshalb man von einem Selbstmordmechanismus des Enzyms spricht.

Exzisionsreparatur

Die gebräuchlichste Methode zur Reparatur von Schäden oder einer Fehlpaarung besteht darin, sie aus der Duplex-DNA herauszuschneiden und den verbleibenden komplementären DNA-Strang neu zu kopieren, wie in Abbildung 7.12 dargestellt. Drei verschiedene Arten der Exzisionsreparatur wurden charakterisiert: Nukleotid-Exzisionsreparatur, Basenexzisionsreparatur und Mismatch-Reparatur. Alle nutzen aausschneiden, kopieren und einfügenMechanismus. ImSchneidenIn diesem Stadium entfernt ein Enzym oder Komplex eine beschädigte Base oder eine Reihe von Nukleotiden aus der DNA. Für dieKopieren, eine DNA-Polymerase (DNA-Polymerase I inE coli) kopiert die Vorlage, um den herausgeschnittenen, beschädigten Strang zu ersetzen. Die DNA-Polymerase kann die Synthese von 3' OH aus initiierenTDer Einzelstrangbruch (Nick) oder die Lücke in der DNA, die nach der Exzision an der Schadensstelle verbleibt. Schließlich in dereinfügenIn diesem Stadium versiegelt die DNA-Ligase den verbleibenden Bruch, sodass eine intakte, reparierte DNA entsteht.

Nukleotid-Exzisionsreparatur (NER)

InNukleotid-Exzisionsreparatur, werden beschädigte Basen innerhalb einer Nukleotidkette herausgeschnitten und durch DNA ersetzt, wie vom unbeschädigten Matrizenstrang vorgegeben. Dieses Reparatursystem wird verwendet, um durch UV-Strahlung gebildete Pyrimidin-Dimere sowie durch sperrige chemische Addukte modifizierte Nukleotide zu entfernen. Das gemeinsame Merkmal von Schäden, die durch Nukleotid-Exzision repariert werden, besteht darin, dass die veränderten Nukleotide eine erhebliche Verzerrung der DNA-Helix verursachen. NER kommt in fast allen untersuchten Organismen vor.

Zu den am besten charakterisierten Enzymen, die diesen Prozess katalysieren, gehören die UvrABC-Exzinuklease und die UvrD-HelikaseE coli.Die Gene, die diese Reparaturfunktion kodieren, wurden als Mutanten entdeckt, die sehr empfindlich gegenüber UV-Schäden sind, was darauf hindeutet, dass die Mutanten bei der UV-Reparatur defekt sind. Wie in Abbildung 7.13 dargestellt, WildtypE coliErst bei höheren Dosen der UV-Strahlung werden Zellen abgetötet. Es lassen sich Mutantenstämme identifizieren, die wesentlich empfindlicher auf UV-Strahlung reagieren; Diese weisen Mängel in den erforderlichen Funktionen aufUV-RResistenz, abgekürztuvr. Durch das Sammeln einer großen Anzahl solcher Mutanten und deren Prüfung auf ihre Fähigkeit, in Kombination die Resistenz gegen UV-Strahlung wiederherzustellen, wurden Komplementationsgruppen identifiziert. Vier der Komplementationsgruppen oder Gene kodieren Proteine, die bei NER eine wichtige Rolle spielen; sie sinduvrA, uvrB,uvrCUnduvrD.

Die von der kodierten EnzymeuvrGene wurden im Detail untersucht. Die Polypeptidprodukte deruvrA,uvrB, UnduvrCGene sind Untereinheiten eines aus mehreren Untereinheiten bestehenden Enzyms namensUvrABC-Exzinuklease. UvrA ist das Protein, das von kodiert wirduvrA, UvrB wird codiert vonuvrB, usw. Der UvrABC-Komplex erkennt schädigungsbedingte Strukturverzerrungen in der DNA, wie zum Beispiel Pyrimidin-Dimere. Es spaltet dann auf beiden Seiten des Schadens. Dann UvrD (auch Helikase II genannt), das Produkt deruvrDDas Gen wickelt die DNA ab und gibt den beschädigten Abschnitt frei. Somit führen die Proteine ​​UvrABC und UvrD bei diesem System eine Reihe von Schritten in der Schneidphase der Exzisionsreparatur durch. Dadurch bleibt ein Substrat mit Lücken für das Kopieren durch DNA-Polymerase und das Einfügen durch DNA-Ligase übrig.

Die UvrABC-Proteine ​​bilden einen dynamischen Komplex, der Schäden erkennt und beidseitig endonukleolytische Schnitte durchführt. Die beiden Schnitte um den Schaden herum ermöglichen das Herausschneiden des einzelsträngigen Segments, das den Schaden enthält, durch die Helikaseaktivität von UvrD. Somit können der dynamische UvrABC-Komplex und der UvrBC-Komplex aufgerufen werdenExzinukleasen. Nachdem der beschädigte Abschnitt herausgeschnitten wurde, verbleibt eine Lücke von 12 bis 13 Nukleotiden in der DNA. Dieser kann durch DNA-Polymerase aufgefüllt und der verbleibende Spalt durch DNA-Ligase versiegelt werden. Da die unbeschädigte Matrize die Synthese durch die DNA-Polymerase steuert, wird die resultierende Duplex-DNA nicht mehr beschädigt.

Im Detail läuft der Prozess wie folgt ab (Abbildung 7.14). UvrA₂(ein Dimer) und Uvr B erkennen die beschädigte Stelle als (UvrA)2UvrB-Komplex. UvrA₂Anschließend dissoziiert es in einem Schritt, der eine ATP-Hydrolyse erfordert. Dies ist eine autokatalytische Reaktion, da sie durch UvrA katalysiert wird, das selbst eine ATPase ist. Nachdem UvrA dissoziiert ist, bildet UvrB (an der beschädigten Stelle) einen Komplex mit UvrC. Der UvrBC-Komplex ist die aktive Nuklease. In einem weiteren Schritt, der ATP erfordert, werden die Einschnitte auf beiden Seiten des Schadens vorgenommen. Das Phosphodiester-Rückgrat wird 8 Nukleotide auf der 5'-Seite des Schadens und 4-5 Nukleotide auf der 3'-Seite gespalten. Schließlich wickelt die UvrD-Helikase die DNA ab, sodass das beschädigte Segment entfernt wird. Das beschädigte DNA-Segment löst sich vom UvrBC-Komplex. Wie bei allen Helikase-Reaktionen erfordert die Entwindung eine ATP-Hydrolyse, um die Basenpaare aufzubrechen. Daher ist in drei Schritten dieser Reaktionsreihe eine ATP-Hydrolyse erforderlich.

Die Nukleotid-Exzisionsreparatur ist in Säugetierzellen sowie in Zellen anderer Organismen sehr aktiv. Die DNA einer normalen Hautzelle, die dem Sonnenlicht ausgesetzt ist, würde täglich Tausende von Dimeren ansammeln, wenn dieser Reparaturprozess sie nicht entfernen würde! Eine genetisch bedingte Erkrankung des Menschen namens Xeroderma pigmentosum (XP) ist eine Hauterkrankung, die durch einen Defekt von Enzymen verursacht wird, die UV-Läsionen entfernen. Aus einzelnen XP-Patienten isolierte Fibroblasten reagieren in Kultur deutlich empfindlich auf UV-Strahlung, ähnlich dem in gezeigten PhänotypE.coliuvrMutanten. Diese XP-Zelllinien können in Kultur fusioniert und auf ihre Fähigkeit getestet werden, die Resistenz gegen UV-Schäden wiederherzustellen. XP-Zelllinien, die dies tun, fallen in verschiedene Komplementationsgruppen. Auf diese Weise wurden mehrere Komplementationsgruppen oder Gene definiert. Bei der Identifizierung der von jedem XP-Gen kodierten Proteine ​​wurden kürzlich erhebliche Fortschritte erzielt (Tabelle 7.2). Beachten Sie die enge Analogie zu den bakteriellen Funktionen, die für NER erforderlich sind. Ähnliche Funktionen finden sich auch in Hefe (Tabelle 7.2). Zu den weiteren Proteinen, die in eukaryotischem NER verwendet werden, gehören hHR23B (das einen Komplex mit dem DNA-Schadenssensor XPC bildet), ERCCI (das mit dem XPF einen Komplex bildet, um den Schnitt 5' zur Schadensstelle zu katalysieren), die verschiedenen anderen Untereinheiten von TFIIH ( siehe Kapitel 10) und das Einzelstrang-Bindungsprotein RPA.

NER kommt in vielen Organismen, einschließlich Bakterien, Hefen und Säugetieren, auf zwei Arten vor. Das eine ist die globale Reparatur, die im gesamten Genom wirkt, und das zweite ist eine spezielle Aktivität, die mit der Transkription gekoppelt ist. Die meisten der in Tabelle 2 aufgeführten XP-Genprodukte funktionieren in beiden NER-Modi in Säugetierzellen. Allerdings ist XPC (das im Komplex mit einem anderen Protein namens hHR23B wirkt) ein DNA-Schadenssensor, der spezifisch für das globale Genom NER ist. Bei der transkriptionsgekoppelten NER bleibt die verlängernde RNA-Polymerase an einer Läsion am Matrizenstrang stehen; Vielleicht ist dies die Schadenserkennungsaktivität für diesen NER-Modus. Einer der basalen Transkriptionsfaktoren, der mit der RNA-Polymerase II assoziiert ist, TFIIH (siehe Kapitel 10), spielt auch bei beiden NER-Typen eine Rolle. Eine seltene genetische Störung beim Menschen, das Cockayne-Syndrom (CS), ist mit einem Defekt verbunden, der spezifisch für die transkriptionsgekoppelte Reparatur ist. Es wurden zwei Komplementationsgruppen identifiziert:CSAUndCSB. Die Bestimmung der Natur und Aktivität der von ihnen kodierten Proteine ​​wird zusätzliche Einblicke in die effiziente Reparatur transkribierter DNA-Stränge liefern. Der Phänotyp von CS-Patienten ist pleiotrop und zeigt sowohl Lichtempfindlichkeit als auch schwere neurologische und andere Entwicklungsstörungen, einschließlich vorzeitiger Alterung. Diese Symptome sind schwerwiegender als diejenigen, die bei XP-Patienten ohne nachweisbares NER beobachtet werden, was darauf hindeutet, dass die transkriptionsgekoppelte Reparatur oder die CS-Proteine ​​zusätzlich zu denen für NER Funktionen haben.

Auch andere genetisch bedingte Erkrankungen resultieren aus einem Mangel an einer DNA-Reparaturfunktion, etwa das Bloom-Syndrom und die Fanconi-Anämie. Dies sind intensive Bereiche der aktuellen Forschung. Eine gute Quelle für aktuelle Informationen zu diesen und anderen Erbkrankheiten sowie zu menschlichen Genen im Allgemeinen ist die Online-Publikation Mendelian Inheritance in Man (OMIM), zugänglich unterhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Ataxia telangiectasia oder AT veranschaulicht die Auswirkungen von Veränderungen in einem Protein, das nicht direkt an der Reparatur beteiligt ist, sondern möglicherweise Signale sendet, die für die ordnungsgemäße Reparatur der DNA erforderlich sind. AT ist eine rezessive, seltene genetische Erkrankung, die durch ungleichmäßigen Gang (Ataxie), Erweiterung der Blutgefäße (Teleangiektasie) in Augen und Gesicht, Kleinhirndegeneration, fortschreitende geistige Behinderung, Immunschwäche, vorzeitiges Altern und eine etwa 100-fache Erhöhung der Anfälligkeit gekennzeichnet ist zu Krebserkrankungen. Dieser letztgenannte Phänotyp weckt großes Interesse an diesem Genort, da Heterozygoten, die etwa 1 % der Bevölkerung ausmachen, auch ein erhöhtes Krebsrisiko haben und möglicherweise bis zu 9 % der Brustkrebserkrankungen in den Vereinigten Staaten ausmachen. Das Gen, das istMutated inBEI(daher „ATM“ genannt) wurde 1995 isoliert und auf Chromosom 11q22-23 lokalisiert.

Das ATM-Gen scheint kein Protein zu kodieren, das direkt an der DNA-Reparatur beteiligt ist (im Gegensatz zu den Genen, die bei Mutation XP verursachen). AT wird vielmehr durch einen Defekt in einem zellulären Signalweg verursacht. Basierend auf Homologien zu anderen Proteinen könnte das ATM-Genprodukt an der Regulierung der Telomerlänge und des Zellzyklusverlaufs beteiligt sein. Die C-terminale Domäne ist homolog zur Phosphatidylinositol-3-Kinase (die auch eine Ser/Thr-Proteinkinase ist) – daher die Verbindung zu Signalwegen. Das ATM-Protein weist auch Regionen mit Homologie zu DNA-abhängigen Proteinkinasen auf, die Brüche, Kerben oder Lücken benötigen, um DNA zu binden (über die Untereinheit Ku); Für die Proteinkinaseaktivität ist die Bindung an DNA erforderlich. Dies deutet darauf hin, dass das ATM-Protein daran beteiligt sein könnte, die Reparaturmaschinerie auf solche Schäden auszurichten.

Reparatur der Basisexzision

Die Basen-Exzisionsreparatur unterscheidet sich von der Nukleotid-Exzisionsreparatur in den erkannten Substrattypen und im anfänglichen Spaltungsereignis. Im Gegensatz zu NER erkennt die Basenexzisionsmaschinerie beschädigte Basen, die keine nennenswerte Verzerrung der DNA-Helix verursachen, wie beispielsweise die Produkte von Oxidationsmitteln. Beispielsweise können durch Basenentfernung Uridine aus der DNA entfernt werden, auch wenn ein G:U-Basenpaar die DNA nicht verzerrt. Die Basenexzisionsreparatur ist vielseitig und dieser Prozess kann auch einige beschädigte Basen entfernen, die die DNA verzerren, wie z. B. methylierte Purine. Im Allgemeinen handelt es sich bei der ersten Erkennung um eine spezifische beschädigte Base und nicht um eine helikale Verzerrung in der DNA. Ein zweiter wesentlicher Unterschied besteht darin, dass die anfängliche Spaltung auf die glykosidische Bindung gerichtet ist, die die Purin- oder Pyrimidinbase mit einer Desoxyribose in der DNA verbindet. Dies steht im Gegensatz zur anfänglichen Spaltung einer Phosphodiesterbindung in NER.

Zellen enthalten eine große Anzahl spezifischerGlykosylasendie beschädigte oder ungeeignete Basen wie Uracil in der DNA erkennen. Die Glykosylase entfernt die beschädigte oder ungeeignete Base, indem sie die Spaltung der N-glykosidischen Bindung katalysiert, die die Base an das Zucker-Phosphat-Rückgrat bindet. Zum Beispiel Uracil-N-Glykosylase, das Produkt derungGen, erkennt Uracil in der DNA und schneidet die N-glykosidische Bindung zwischen der Base und der Desoxyribose (Abbildung 7.15). Andere Glykosylasen erkennen und spalten beschädigte Basen. Beispielsweise entfernt Methylpuringlykosylase methyliertes G und A aus der DNA. Das Ergebnis der Aktivität dieser Glykosylasen ist eine Apurin-/Apyrimidin-Stelle oder AP-Stelle (Abbildung 7.15). An einer AP-Stelle ist die DNA immer noch ein intakter Duplex, d. h. es gibt keine Brüche im Phosphodiester-Rückgrat, aber eine Base ist weg.

Als nächstes einAPEndonukleaseschneidet die DNA nur 5 Fuß von der AP-Stelle entfernt ein und stellt so einen Primer für die DNA-Polymerase bereit. InE coliDie 5'-zu-3'-Exonukleasefunktion der DNA-Polymerase I entfernt den beschädigten Bereich und füllt ihn mit korrekter DNA auf (unter Verwendung der 5'-zu-3'-Polymerase, gesteuert durch die Sequenz des unbeschädigten Komplementärstrangs).

Es wurden zusätzliche Mechanismen entwickelt, um U aus der DNA herauszuhalten.E.coliverfügt auch über eine dUTPase, die von der codiert wirdIch habeGen, das die Hydrolyse von dUTP zu dUMP katalysiert. Das Produkt dUMP ist das Substrat für die Thymidylatsynthetase, die die Umwandlung von dUMP in dTMP katalysiert. Dadurch wird die dUTP-Konzentration in der Zelle niedrig gehalten und die Wahrscheinlichkeit verringert, dass es bei der DNA-Synthese verwendet wird. Somit ist die kombinierte Wirkung der Produkte derIch habe+ungGene tragen dazu bei, die Ansammlung von U's in der DNA zu verhindern.

Reparatur von Fehlanpassungen

Die dritte Art der Exzisionsreparatur, die wir betrachten werden, istReparatur von Fehlanpassungen, das zur Reparatur von Fehlern verwendet wird, die bei der DNA-Synthese auftreten. Das Korrekturlesen während der Replikation ist gut, aber nicht perfekt. Selbst bei einer funktionierenden e-Untereinheit ermöglicht die DNA-Polymerase III, dass etwa einmal pro synthetisierte 108 bp das falsche Nukleotid eingebaut wirdE coli. Die gemessene Mutationsrate bei Bakterien beträgt jedoch nur einen Fehler pro 1010 oder 1011 bp. Die Enzyme, die katalysierenNichtübereinstimmungReparatursind für diesen letzten Grad an Genauigkeit verantwortlich. Sie erkennen falsch eingebaute Nukleotide, schneiden sie heraus und ersetzen sie durch die richtigen Nukleotide. Im Gegensatz zur Nukleotid-Exzisionsreparatur wirkt sich die Fehlpaarungsreparatur nicht auf sperrige Addukte oder größere Verzerrungen der DNA-Helix aus. Bei den meisten Fehlpaarungen handelt es sich um Ersatzstoffe innerhalb einer chemischen Klasse, z. ein C anstelle eines T eingebaut. Dies führt nur zu geringfügigen helikalen Verzerrungen in der DNA, und das falsch eingebaute Nukleotid ist ein normaler Bestandteil der DNA. Die Fähigkeit einer Zelle, eine Nichtübereinstimmung zu erkennen, spiegelt die exquisite Spezifität von widerDeckel, das normale Basenpaare von solchen unterscheiden kann, die durch Fehleinbau entstehen. Natürlich muss die Reparaturmaschinerie wissen, welches der Nukleotide an einem Fehlpaar das richtige ist und welches falsch eingebaut wurde. Dazu wird ermittelt, welcher Strang kürzlich synthetisiert wurde, und die Fehlpaarung am entstehenden Strang repariert.

InE coli, stellt die Methylierung von A in einem GATC-Motiv einen kovalenten Marker für den Elternstrang dar, daher wird die Methylierung der DNA verwendet, um Eltern- und Nachkommenstränge zu unterscheiden. Denken Sie daran, dass dieDammMethylasekatalysiert die Übertragung einer Methylgruppe auf das A der pseudopalindromischen Sequenz GATC in Duplex-DNA. Die Methylierung verzögert sich nach der Replikation um einige Minuten. IN diesem Zeitraum vor der Methylierung des neuen DNA-Strangs kann das Mismatch-Reparatursystem Fehlpaarungen finden und seine Reparaturaktivität auf Nukleotide auf dem nicht methylierten, neu replizierten Strang richten. Dadurch werden Replikationsfehler bevorzugt entfernt.

Der Enzymkomplex MutH-MutL-MutS oder MutHLS katalysiert die Reparatur von FehlpaarungenE coli. Die Gene, die diese Enzyme kodieren,mutH,GlücklichUndDeckelwurden entdeckt, weil Stämme, die Mutationen in sich tragen, eine hohe Häufigkeit neuer Mutationen aufweisen. Dies nennt man aMutator-Phänotyp, und daher der Namemutwurde diesen Genen gegeben. Nicht alle Mutatorgene sind an der Reparatur von Fehlpaarungen beteiligt. Beispielsweise weisen Mutationen im Gen, das für das Korrekturleseenzym der DNA-Polymerase III kodiert, auch einen Mutator-Phänotyp auf. Dieses Gen wurde unabhängig bei Tests auf Defekte in der DNA-Replikation entdeckt (dnaQ) und Mutatorgene (mutD). Drei Komplementationsgruppen innerhalb des Satzes von Mutator-Allelen sind hauptsächlich an der Reparatur von Fehlpaarungen beteiligt. diese sindmutH,GlücklichUndDeckel.

Deckelerkennt sieben der acht möglichen fehlgepaarten Basenpaare (außer C:C) und bindet an dieser Stelle in der Duplex-DNA (Abbildung 7.16).MutHUndGlücklich(mit gebundenem ATP) verbinden sich dann mit dem Komplex, der sich dann entlang der DNA in beide Richtungen bewegt, bis er ein hemimethyliertes GATC-Motiv findet, das einige tausend Basenpaare entfernt sein kann. Bis zu diesem Zeitpunkt ruhte die Nukleasefunktion von MutH, sie wird jedoch in Gegenwart von ATP an einem hemimethylierten GATC aktiviert. Es spaltet den unmethylierten DNA-Strang und hinterlässt einen Bruch 5' zum G auf dem Strang, der das unmethylierte GATC enthält (d. h. der neue DNA-Strang). Derselbe Strang ist auf der anderen Seite der Fehlpaarung eingekerbt. Enzyme, die an anderen Reparatur- und Replikationsprozessen beteiligt sind, katalysieren die verbleibenden Schritte. Der Abschnitt der einzelsträngigen DNA, der das falsche Nukleotid enthält, soll durch UvrD, auch bekannt als Helikase II und MutU, herausgeschnitten werden. An der Exzision sind auch SSB und Exonuklease I beteiligt. Während der Exzisionsprozess die Lücke bildet, wird sie durch die konzertierte Wirkung der DNA-Polymerase III gefüllt (Abbildung 7.16.).

Die Fehlpaarungsreparatur ist hochkonserviert, und die Untersuchung dieses Prozesses bei Mäusen und Menschen liefert neue Hinweise auf Mutationen, die Krebs verursachen. Homologe dazuE coliGeneGlücklichUndDeckelwurden bei vielen anderen Arten, einschließlich Säugetieren, identifiziert. Der entscheidende Durchbruch gelang durch die Analyse von Mutationen, die eine der häufigsten erblichen Krebsarten verursachen:erblicher nichtpolypöser Dickdarmkrebs(HNPCC). Einige der Gene, die bei Mutation diese Krankheit verursachen, kodieren für Proteine, deren Aminosäuresequenzen denen von zwei dieser Gene deutlich ähnelnE.coliFehlpaarungsreparaturenzyme. Die menschlichen Gene werden aufgerufenhMLH1(für MenschenGlücklichHomolog 1),hMSH1, UndhMSH2(für MenschenDeckelHomolog 1 bzw. 2). Nachfolgende Arbeiten haben gezeigt, dass diese Enzyme beim Menschen an der Reparatur von Fehlpaarungen beteiligt sind. Vermutlich führt die erhöhte Häufigkeit von Mutationen in Zellen, denen die Fehlpaarungsreparatur fehlt, zur Anhäufung von Mutationen in Protoonkogenen, was zu einer Fehlregulation des Zellzyklus und dem Verlust der normalen Kontrolle über die Zellteilungsrate führt.

Rekombinationsreparatur (Rückgewinnungssystem)

Bei den drei Arten der Exzisionsreparatur werden die beschädigten oder falsch eingebauten Nukleotide aus der DNA herausgeschnitten und der verbleibende DNA-Strang wird für die Synthese der richtigen DNA-Sequenz verwendet. Allerdings ist dieser komplementäre Strang nicht immer verfügbar. Manchmal muss die DNA-Polymerase an einer Läsion vorbei synthetisieren, beispielsweise an einem Pyrimidin-Dimer oder einer AP-Stelle. Eine Möglichkeit besteht darin, auf einer Seite der Läsion anzuhalten und die Synthese dann etwa 1000 Nukleotide weiter unten fortzusetzen. Dadurch entsteht eine Lücke im Strang gegenüber der Läsion (Abbildung 7.17).

Die an der Lücke benötigten Informationen werden aus dem normalen Tochtermolekül abgerufen, indem mithilfe der RecA-vermittelten Rekombination ein einzelner DNA-Strang eingebracht wird (siehe Kapitel VIII). Dadurch wird die Lücke gegenüber dem Dimer gefüllt und das Dimer kann nun durch Exzisionsreparatur ersetzt werden (Abbildung 7.17). Die entstandene Lücke in der (vorher) normalen Tochter kann mithilfe der guten Vorlage durch DNA-Polymerase gefüllt werden.

Translesionssynthese

Wie gerade beschrieben, kann die DNA-Polymerase an einer Läsion am Matrizenstrang vorbeispringen und eine Lücke hinterlassen. Wenn eine solche Läsion auftritt, besteht eine weitere Option darin, DNA auf nicht-schablonengesteuerte Weise zu synthetisieren. Das nennt manÜbersetzungssynthese, Bypass-Synthese oder fehleranfällige Reparatur. Dies ist der letzte Ausweg zur DNA-Reparatur, z.B. wenn vor der Replikation keine Reparatur erfolgt ist. Bei der Translesionsreplikation wechselt die DNA-Polymerase von der templatgesteuerten Synthese zur Katalyse des Einbaus zufälliger Nukleotide. Bei diesen zufälligen Nukleotiden handelt es sich in der Regel um Mutationen (d. h. in drei von vier Fällen), weshalb dieser Vorgang auch als fehleranfällige Reparatur bezeichnet wird.

Die Translesionssynthese verwendet die Produkte derumuCUndähmDGene. Diese Gene sind nach dem benanntUV nichtInTabellenphänotyp von Mutanten mit Defekten in diesen Genen

UmuD bildet ein Homodimer, das auch mit UmuC einen Komplex bildet. Wenn die Konzentration von einzelsträngiger DNA und RecA erhöht wird (durch DNA-Schädigung, siehe nächster Abschnitt), stimuliert RecA eine Autoproteaseaktivität in UmuD₂UmuD‘ bilden₂. Diese gespaltene Form ist nun in der transläsionalen Synthese aktiv. UmuC selbst ist eine DNA-Polymerase. Ein Komplex aus mehreren Untereinheiten, der UmuC, das aktivierte UmuD, enthält.₂und die a-Untereinheit der DNA-Polymerase III katalysieren die transläsionale Synthese. Homologe der UmuC-Polymerase kommen in Hefe (RAD30) und Menschen (XP-V) vor.

Die SOS-Antwort

Eine koordinierte Batterie von Reaktionen auf DNA-Schäden inE.coliwird als SOS-Antwort bezeichnet. Dieser Name leitet sich vom Seenotruf „SOS“ für „Save Our Ship“ ab. Häufende Schäden an der DNA, z.B. Durch hohe Strahlungsdosen, die das DNA-Rückgrat zerstören, entstehen einzelsträngige Regionen in der DNA. Die zunehmenden Mengen einzelsträngiger DNA induzieren SOS-Funktionen, die sowohl die Rekombinationsreparatur als auch die gerade diskutierte transläsionale Synthese stimulieren.

Schlüsselproteine ​​in der SOS-Reaktion sindRecAUndLexA. RecA bindet an einzelsträngige Regionen in der DNA, wodurch neue Funktionen im Protein aktiviert werden. Eine davon ist die Fähigkeit, eine latente proteolytische Aktivität weiter zu aktivieren, die in mehreren Proteinen zu finden ist, einschließlich des LexA-RepressorsUmuDProtein und der vom Bakteriophagen Lambda kodierte Repressor (Abbildung 7.18). RecA, das durch Bindung an einzelsträngige DNA aktiviert wird, ist selbst keine Protease, sondern dient vielmehr als Co-Protease und aktiviert die latente proteolytische Funktion in LexA, UmuD und einigen anderen Proteinen.

Wenn kein nennenswerter DNA-Schaden vorliegt, unterdrückt das LexA-Protein viele Operons, darunter mehrere Gene, die für die DNA-Reparatur benötigt werden:recA, lexA, uvrA, uvrB und umuC.Wenn das aktivierte RecA seine proteolytische Aktivität stimuliert, spaltet es sich selbst (und andere Proteine), was zu einer koordinierten Induktion der SOS-regulierten Operons führt (Abbildung 7.18).

Beschränkungs-/Änderungssysteme

Die oben besprochenen DNA-Reparatursysteme überwachen das Genom auf Schäden oder Fehleinbauten und setzen dann enzymatische Maschinen ein, um die Defekte zu reparieren. Andere Überwachungssysteme in bakteriellen Genomen sindBeschränkungs-/Änderungssysteme. Diese suchen nach fremder DNA, die in die Zelle eingedrungen ist, und zerstören diese anschließend. Tatsächlich ist dies eine weitere Möglichkeit, das Genom vor Schäden zu schützen, die durch die Integration fremder DNA entstehen könnten.

Diese Systeme zum Schutz der Bakterienzelle vor dem Eindringen fremder DNA nutzen eine Kombination aus kovalenter Modifikation und Restriktion durch eine Endonuklease. Jede Bakterienart verändert ihre DNA durchMethylierungan bestimmten Standorten (Abbildung 7.19). Dies schützt die DNA vor der Spaltung durch das entsprechendeRestriktionsendonuklease. Allerdings wird jegliche fremde DNA (z. B. von einem infizierenden Bakteriophagen oder von einer anderen Bakterienart) an dieser Stelle nicht methyliert und die Restriktionsendonuklease wird dort spalten. Das Ergebnis ist, dass eindringende DNA zerschnitten und inaktiviert wird, ohne die Wirts-DNA zu schädigen.

Jede DNA, die der Restriktionsendonuklease entgeht, ist ein Substrat für die Methylase. Einmal methyliert, behandelt das Bakterium es nun wie seine eigene DNA, spaltet sie also nicht. Dieser Prozess kann genetisch und biochemisch kontrolliert werden, um die rekombinante DNA-Arbeit zu unterstützen. Im Allgemeinen wird die Restriktionsendonuklease am kodiertRLocus und die Methyltransferase wird am kodiertMOrt. So wird eine Plasmid-DNA durch eine geleitetr‑m+Stamm (defekt in der Restriktion, aber kompetent zur Modifikation) macht ihn resistent gegen die Restriktion durch Stämme mit einem Wildtypr+Gen. Für einige Restriktions-/Modifikationssysteme sind sowohl die Endonuklease als auch die Methyltransferase im Handel erhältlich. In diesen Fällen kann man die fremde DNA (z. B. von Menschen) vor der Ligation in Klonierungsvektoren modifizieren, um sie vor der Spaltung durch Restriktionsendonukleasen zu schützen, auf die sie nach der Transformation in Bakterien stoßen könnte.

Bei den Restriktions-/Modifikationssystemen vom Typ II erfolgen Methylierung und Restriktion an derselben pseudopalindromischen Stelle. Dies sind die häufigsten Systeme mit unterschiedlicher Sequenzspezifität für jede Bakterienart. Dadurch entstand die große Vielfalt an Restriktionsendonukleasen, die in der Molekularbiologie so häufig verwendet werden.

Mitwirkende und Namensnennungen

• Ross C. Hardison, T. Ming Chu Professor fürBiochemie und Molekularbiologie(Die Pennsylvania State University)